一、裝載探針:
對于刺激時間較短(通常為2 小時以內(nèi))的細(xì)胞,先裝載探針,后用活性氧陽性對照或自己感興趣的藥物刺激細(xì)胞。對于細(xì)胞刺激時間較長(通常為6 小時以上)的細(xì)胞,先用活性氧陽性對照或自己感興趣的藥物刺激細(xì)胞,后裝載探針。
原位裝載探針:本方法僅適用于貼壁培養(yǎng)細(xì)胞。按照1 ∶1000用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA,使終濃度為10μ mol/L。去除細(xì)胞培養(yǎng)液,加入適當(dāng)體積稀釋好的DCFH-DA。加入的體積以能充分蓋住細(xì)胞為宜,通常對于六孔板的一個孔加入稀釋好的DCFH-DA不少于1mL 。37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 分鐘。用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞三次,以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。通?;钚匝蹶栃詫φ赵诖碳ぜ?xì)胞20~30分鐘后可以顯著提高活性氧水平。
收集細(xì)胞后裝載探針:按照1 ∶1000 用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA,使終濃度為10μmol/L。細(xì)胞收集后懸浮于稀釋好的DCFH-DA中,細(xì)胞濃度為一百萬二千萬/mL ,37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20分鐘。每隔3 ~5 分鐘顛倒混勻一下,使探針和細(xì)胞充分接觸。用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞三次,以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。直接用活性氧陽性對照或自己感興趣的藥物刺激細(xì)胞,或把細(xì)胞等分成若干份后刺激細(xì)胞。通?;钚匝蹶栃詫φ赵诖碳ぜ?xì)胞20~30分鐘后可以顯著提高活性氧水平。
說明:僅在陽性對照孔中加入Rosup作為陽性對照,其余孔不必加入Rosup。
二、檢測:
對于原位裝載探針的樣品可以用激光共聚焦顯微鏡直接觀察,或收集細(xì)胞后用熒光分光光度計、熒光酶標(biāo)儀或流式細(xì)胞儀檢測。對于收集細(xì)胞后裝載探針的樣品可以用熒光分光光度計、熒光酶標(biāo)儀或流式細(xì)胞儀檢測,也可以用激光共聚焦顯微鏡直接觀察。
三、參數(shù)設(shè)置
使用488nm 激發(fā)波長,525nm 發(fā)射波長,實時或逐時間點(diǎn)檢測刺激前后熒光的強(qiáng)弱。DCF 的熒光光譜和FITC非常相似,可以用FITC的參數(shù)設(shè)置檢測DCF 。