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疫情面前,彰顯擔當--來自軍科院的感謝函
 骨關(guān)節(jié)炎(OA)是常見的關(guān)節(jié)疾病之一,是關(guān)節(jié)運動過程中慢性疼痛導(dǎo)致殘疾的主要原因。然而,骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機制是復(fù)雜的,目前仍知之甚少。因此迫切需要開發(fā)治療骨關(guān)節(jié)炎安全有效的策略。通常,骨關(guān)節(jié)炎的特征是軟骨退化、軟骨細胞凋亡和滑膜慢性炎癥。腫瘤壞死因子-α(TNF-α)是重要的促炎細胞因子之一,參與包括骨關(guān)節(jié)炎在內(nèi)的各種慢性炎癥疾病。TNF-α的過度表達促進炎癥,炎癥通過誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)的產(chǎn)生,特別是MMP-3和MMP-13的產(chǎn)生,在OA的發(fā)生和進展中起著至關(guān)重要的作用。

MMP-3和MMP-13負責(zé)II型膠原的降解。MMP還抑制SRY相關(guān)高遷移率族蛋白9(SOX-9)的表達,SOX-9是一種廣泛*的參與軟骨形成的轉(zhuǎn)錄因子。因此,TNF-α是治療骨關(guān)節(jié)炎常用的治療靶點。干擾素調(diào)節(jié)因子(IRF)-1是骨關(guān)節(jié)炎中調(diào)節(jié)MMP轉(zhuǎn)錄的另一個關(guān)鍵因子。IRF-1的上調(diào)增強了MMP-3和MMP-13的表達,從而促進軟骨降解。此外,據(jù)報道氧化應(yīng)激是軟骨細胞凋亡的效應(yīng)物。活性氧的過量產(chǎn)生誘導(dǎo)JAK2/STAT1途徑的激活,該途徑調(diào)節(jié)細胞因子、酶和其他與骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)因子的表達。

G蛋白偶聯(lián)受體17(GPR17)是G蛋白偶聯(lián)受體(GPCRs)超家族的一個孤兒受體。研究表明,GPR17在肺纖維化小鼠模型中可以介導(dǎo)促炎細胞因子如TNF-α的表達。這表明GPR17的阻斷可能是治療炎癥相關(guān)疾病的一種有前途的方法。然而,GPR17在OA中的生理功能還沒有研究。有報道稱普侖司特對GPR17信號有抑制作用,被認為是一種合成的GPR17抑制劑,這為研究其在不同細胞中的作用提供了有力的工具。本研究的目的是研究普侖司特是否能通過阻斷GPR17的激活而對II型膠原的降解起到保護作用。

 

 

基本信息

題目:

Inhibition of GPR17 with pranlukast protects against TNF-α-induced loss of type II collagen in ATDC5 cells

期刊:International Immunopharmacology

影響因子:3.943

PMID:32805694 

通訊作者:楊廣勇

作者單位:溫州醫(yī)科大學(xué)附屬臺州醫(yī)院

索萊寶合作產(chǎn)品:

產(chǎn)品名稱

產(chǎn)品貨號

Mouse MMP-13 ELISA KIT

SEKM-0172

 

摘 要

 

骨關(guān)節(jié)炎(OA)是一種常見的關(guān)節(jié)疾病,影響著*數(shù)百萬的老年人。然而,OA的機制是復(fù)雜的,人們對其了解甚少。因此,安全有效的治療策略還有待發(fā)展。G蛋白偶聯(lián)受體17(GPR17)是一種廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的孤兒受體。GPR17已成為治療腦部疾病炎癥的靶點。在這項研究中,作者證明了GPR17在ATDC5細胞中表達,并且在腫瘤壞死因子-α(TNF-α)暴露時增加。作者還發(fā)現(xiàn)普侖司特拮抗GPR17可以通過下調(diào)細胞內(nèi)活性氧(ROS)水平和增加超氧化物歧化酶(SOD)對TNF-α的活性而顯著抑制氧化應(yīng)激。有趣的是,普侖司特治療可防止TNF-α誘導(dǎo)的II型膠原減少。此外,siRNA敲除GPR17可改善TNF-α誘導(dǎo)的II型膠原的降低,這表明GPR17在介導(dǎo)II型膠原損傷中具有重要的作用。普侖司特阻斷GPR17,可抑制基質(zhì)金屬蛋白酶3(MMP-3)和基質(zhì)金屬蛋白酶13(MMP-13)的表達,MMP可導(dǎo)致II型膠原的降解。普侖司特還可以抑制JAK2/STAT1/IRF-1信號通路的激活,從而抑制促炎細胞因子和酶的表達。此外,普侖司特挽救了TNF-α誘導(dǎo)的SOX-9表達降低??傊?,這些數(shù)據(jù)表明GPR17可能是治療OA的潛在靶點。

 
 

研究內(nèi)容及結(jié)果

 

1.GPR17在ATDC5細胞中表達

作者首先評估GPR17是否在ATDC5細胞中表達。為了評價GPR17的表達情況,作者以G422細胞作為陽性對照,因為GPR17在G422細胞中表達較高。圖1A的RT-PCR分析結(jié)果顯示,與G422細胞中的表達水平相比,ATDC5細胞中GPR17在基因水平上有良好的表達。同樣,通過Western blot分析,作者證實GPR17在ATDC5細胞中在蛋白水平上高度表達,如圖1B所示。

圖1

2.TNF-α增加ATDC5細胞中GPR17的表達

接下來,作者測定了TNF-α對ARDC5細胞中GPR17表達的影響。圖2A中的結(jié)果顯示,與基線相比,三種劑量的TNF-α將GPR17的mRNA水平分別增加到1.7倍、2.3倍和2.8倍。圖2B顯示,經(jīng)TNF-α處理后,GPR17的蛋白質(zhì)水平升高到1.6倍、2.1倍和2.5倍??偟膩碚f,TNF-α在基因和蛋白質(zhì)水平上都表現(xiàn)出很強的促進GPR17表達的能力。

圖2

3.普侖司特可降低TNF-α誘導(dǎo)的ATDC5細胞氧化應(yīng)激

普侖司特的分子結(jié)構(gòu)如圖3A所示。為了確定普侖司特對TNF-α誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激的影響,作者測定了ROS和SOD的水平。如圖3B所示,TNF-α誘導(dǎo)細胞內(nèi)ROS水平增加了3.3倍,用5μM和10μM普侖司特處理后,細胞內(nèi)ROS水平僅增加到2.4倍和1.6倍。同時,TNF-α將SOD活性降至15.6U/100mg蛋白質(zhì),而基線時為31.1U/100mg蛋白質(zhì)。然而,5μM普侖司特將SOD活性提高到23.4U/100mg蛋白質(zhì),10μM普侖司特進一步將其提高到29.8U/100mg蛋白質(zhì)(圖3C),接近基線水平。普侖司特表現(xiàn)出劑量依賴性的抗氧化作用。

圖3

4.普侖司特抑制TNF-α誘導(dǎo)的II型膠原減少

抑制細胞中II型膠原降解是預(yù)防和治療OA的普遍靶點。這篇研究中,作者試圖確定普侖司特對TNF-α誘導(dǎo)的II型膠原減少的影響。Col2a1的mRNA水平在單獨暴露于TNF-α時降低到45%,而用5μM和10μM普侖司特處理時,Col2a1的mRNA水平分別上升到68%和92%,結(jié)果如圖4A所示。圖4B顯示,與上述相同劑量的普侖司特可使Ⅱ型膠原的蛋白質(zhì)含量提高到71%和94%,而TNF-α處理組的Ⅱ型膠原的蛋白質(zhì)含量為51%。

圖4

5.GPR17的敲除在基因和蛋白水平上都阻止了TNF-α誘導(dǎo)的II型膠原減少

普侖司特作為GPR17的*拮抗劑,其對ATDC5細胞的保護作用可能是通過阻斷GPR17的表達而實現(xiàn)的。為了驗證這一理論,作者使用siRNA沉默GPR17的表達(圖5A)。圖5B和5C的結(jié)果顯示,GPR17的敲除對TNF-α誘導(dǎo)的Col2a1基因和II型膠原蛋白的減少具有保護作用。這些發(fā)現(xiàn)表明GPR17的表達介導(dǎo)II型膠原的減少。

在補充材料中,作者檢測了普侖司特對GPR17表達的影響。結(jié)果表明,普侖司特在基礎(chǔ)條件下和TNF-α處理下均降低了GPR17在mRNA水平和蛋白水平上的表達。重要的是,作者發(fā)現(xiàn)GPR17的過表達消除了普侖司特對Col2a1基因表達和II型膠原蛋白表達的保護作用。這些研究結(jié)果表明,普侖司特對TNF-α誘導(dǎo)的II型膠原減少中的有益作用是通過抑制GPR17介導(dǎo)的。

圖5

6.普侖司特在ATDC5細胞中可恢復(fù)TNF-ɑ誘導(dǎo)的SOX-9的減少

SOX-9是一種在軟骨形成中起重要作用的轉(zhuǎn)錄因子。SOX-9的表達對抑制TNF-α誘導(dǎo)的II型膠原降解具有重要作用。如圖6A中所示,TNF-α誘導(dǎo)SOX-9的mRNA水平降低52%,分別用5μM和10μM普侖司特處理后可增加到73%和95%。與單獨TNF-α處理組相比(55%),與上述相同劑量的普侖司特將SOX-9的蛋白質(zhì)水平分別提高到76%和97%(圖6B)。

圖6

7.普侖司特在ATDC5細胞中可降低TNF-ɑ誘導(dǎo)的MMP-3和MMP-13的表達

由于MMP-3和MMP-13被認為是參與II型膠原降解的重要的酶,因此作者確定了普侖司特對這兩種蛋白表達的影響。圖7A顯示,TNF-α刺激后,MMP-3和MMP-13的mRNA水平分別增加了3.2倍和3.9倍。然而,5μM的普侖司特將MMP-3和MMP-13 mRNA水平分別降低到2.1倍和2.3倍,10μM的普侖司特將MMP-3和MMP-13 mRNA水平分別降低到1.5倍和1.7倍。與之一致的是,圖7B的結(jié)果顯示,經(jīng)TNF-α處理后,MMP-3和MMP-13的蛋白水平上升至342.3pg/mL和645.3pg/mL,高于基線時的89.5pg/mL和139.2pg/mL。同時,5和10μM普侖司特將MMP-3的蛋白水平分別降低到265.7和185.6pg/mL,MMP-13的蛋白水平分別降低到466.9和327.5pg/mL。

圖7

8.普侖司特在ATDC5細胞中可抑制TNF-ɑ誘導(dǎo)的IRF-1的表達

MMP-3和MMP-13受IRF-1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。在這里,作者測定了普侖司特對TNF-α誘導(dǎo)的IRF-1表達的影響。圖8A的結(jié)果顯示,TNF-α誘導(dǎo)IRF-1在基因水平上的表達增加了3.2倍,而用5μM和10μM普侖司特處理后,IRF-1的表達分別下降到2.1和1.4倍。如預(yù)期一致,圖8B所示,兩劑量的普侖司特分別將IRF-1的蛋白水平降低到1.9倍和1.5倍,相比之下,單獨使用TNF-α處理的IRF-1蛋白水平為2.9倍。后,圖8C的免疫染色結(jié)果顯示,單獨TNF-α處理后,IRF-1的表達明顯增加到3.2倍。然而,5μM普侖司特可使IRF-1水平降低到2.2倍,10μM普侖司特可使IRF-1水平進一步降低到1.6倍。

圖8

9.普侖司特抑制TNF-α誘導(dǎo)的JAK2/STAT1通路的激活

JAK2/STAT1通路已被證明在OA中調(diào)節(jié)細胞因子和MMPs的產(chǎn)生中發(fā)揮關(guān)鍵作用。這項研究中,作者確定了普侖司特阻斷GPR17是否會抑制JAK2/STAT1通路的激活。如圖9所示,Western Blot分析顯示,與基線相比,TNF-α處理顯著提高了p-JAK2和p-STAT1的水平,約為2.7倍和2.9倍。而5μM普侖司特抑制p-JAK2和p-STAT1的表達,分別為2.1倍和1.9倍。此外,10μM普侖司特進一步將這些值降低到1.5和1.4倍。普侖司特對TNF-α誘導(dǎo)的JAK2/STAT1通路的激活具有較強的抑制作用。

圖9

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結(jié) 論

綜上所述,作者的研究提供了新的證據(jù),表明普侖司特通過阻斷GPR17的表達,對TNF-α誘導(dǎo)的II型膠原降解具有保護作用。作者的發(fā)現(xiàn)提示GPR17可能是治療OA的一個潛在靶點。然而,還需要更多的試驗來進一步研究GPR17及其拮抗劑對骨關(guān)節(jié)炎進展和發(fā)展的影響。

 

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