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干貨|ELISA實驗做不好,索萊寶FAQ來幫你

 2020年就像一列疾馳的列車,雖然經(jīng)歷彷徨、迷茫,但終于駛過寒冬,駛向春天。2021帶著我們美好的愿望如期而至。在新年的伊始,我們?yōu)榇蠹宜蜕狭薊LISA的一些大干貨,趕緊收藏起來吧!

 

 

 

ELISA原理

 
 

酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay,簡寫ELISA)指將抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面,并保持其免疫活性。使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體,這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性,又保留酶的活性。在測定時,把受檢標(biāo)本(測定其中的抗體或抗原)和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開,后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后,底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物,產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān),故可根據(jù)顏色反應(yīng)的有無深淺定性或定量分析。由于酶的催化效率很高,故可地放大反應(yīng)效果,從而使測定方法達(dá)到很高的敏感度。

 

 

ELISA常見分類

 

01

直接ELISA

 

特點:在直接ELISA中,抗原被固定在多孔板表面,用一種針對該抗原的抗體檢測,該抗體直接與HRP或其他檢測分子結(jié)合。

優(yōu)點:簡單快速,避免交叉反應(yīng)。

缺點:潛在高背景,沒有信號放大。

02

間接ELISA

 

特點:固相載體包被抗原,酶標(biāo)記二抗,主要用于測抗體。 

優(yōu)點:使用酶標(biāo)二抗增加了靈敏度,靈活度大,成本低。 

缺點:交叉反應(yīng)幾率升高。

用途:通過檢測血清中的抗體來檢測病毒,如第1,2代艾滋病診斷試劑。于免疫動物血清中抗體含量的測定。

03

雙抗夾心ELISA

 

特點:使用兩個特異性單抗或者1個特異性單抗和1個特異性多抗,固相載體包被抗體,酶標(biāo)記特異性抗體作為檢測抗體。

優(yōu)點:使用兩個特異性抗體檢測,特異性好。

缺點:成本高。

用途:用于抗原的定量檢測。

04

競爭ELISA

 

特點:包被抗體,標(biāo)記抗原,樣本中的抗原與酶標(biāo)抗原競爭與固相抗體結(jié)合,標(biāo)本中抗原含量越多,結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗原越少,后的顯色也越淺。

缺點:整體的敏感性和專一性都較差。

用途:小分子抗原或者半抗原的定量檢測,當(dāng)抗原材料中干擾物質(zhì)不易去除或不易得到足夠的純化抗原時,多用于此方法檢測;一般小分子激素及藥物常用此法測定。

 

ELISA常見問題

 

Q1

為什么推薦雙波長檢測(450nm和630nm)?

 

A:ELISA實驗終止后形成的是黃色物質(zhì),該物質(zhì)需要在450nm處測定其吸光度,630nm的吸光度只是檢測板子本身的吸光度,與酶標(biāo)板的材質(zhì)有關(guān),測OD630可以消除各個板孔不干凈等非特異性因素引起的誤差。如果所使用的酶標(biāo)儀不可以檢測OD630也沒有關(guān)系,只讀取OD450的結(jié)果也可以。

數(shù)據(jù)處理時所用的矯正值,是把所有孔的OD值減去標(biāo)準(zhǔn)曲線0濃度孔的OD值,進(jìn)一步計算結(jié)果。

 

Q2

CV值指的是什么?

 

A:CV值是統(tǒng)計學(xué)中的一個概念,中文是變異系數(shù),可以認(rèn)為變異系數(shù)和極差、標(biāo)準(zhǔn)差和方差一樣,都是反映數(shù)據(jù)離散程度的值。CV值越小,說明數(shù)據(jù)的波動程度越小。在描述板內(nèi)、板間實驗結(jié)果是否一致時常用到CV值,其越小,說明批內(nèi)及批間差越小,試劑盒質(zhì)量越好。

 

Q3

標(biāo)曲擬合方式的方法?

 

A:ELISA數(shù)據(jù)處理中所謂的“標(biāo)準(zhǔn)曲線”其實稱為擬合曲線比較合適。標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合方式有多種,直線、二次曲線、三次曲線、指數(shù)、對數(shù)等雖都可用于ELISA及其它生物學(xué)反應(yīng)中的曲線擬合,但都只適用于曲線的一部分,有的適用于前半段,有的適用于后半段,有的適用于中間一段,而四參數(shù)Logistic曲線擬合則對曲線的全部都有較好的適用性。目前上的免疫檢測擬合方式是“四參數(shù)Logistic擬合",用這種擬合方式往往能夠比較的反映濃度和吸光度的曲線關(guān)系,從而進(jìn)一步比較正確地獲得樣品中待測物質(zhì)的濃度值。

建議用專門的軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,這樣可以快速、準(zhǔn)確地計算出結(jié)果。

 

Q4

明確標(biāo)明種屬的試劑盒可以用來檢測其他

種屬的樣本嗎?

 

A:ELISA試劑盒嚴(yán)格區(qū)分種屬,一般不推薦跨種屬檢測,不同種屬的同一個指標(biāo)同源性相差可能會很大,抗體的特異性要求比較高,不同種屬樣本與抗體結(jié)合能力會有很大差別。

 

Q5

ELISA試劑盒只能檢測血清、血漿、細(xì)胞

上清液嗎?

 

A:通常我們可用于ELISA檢測的樣本是有多種類型的,包括血清、血漿、細(xì)胞上清等常規(guī)樣品,而對于尿液、細(xì)組織勻漿液、細(xì)胞裂解液等樣品,目前市面上很多廠家的產(chǎn)品都沒有相關(guān)的驗證數(shù)據(jù),理論上可以檢測,客戶如有需要可以自行測試。需要注意的是,不同類型的檢測樣本前期的處理方法是不一樣的。樣品中含有影響生物活性的物質(zhì)會影響檢測結(jié)果。

 

Q6

試劑盒在使用前要室溫放置30min,目的

是什么?

 

A:ELISA試劑盒對于溫度的要求比較嚴(yán)格,溫度是ELISA結(jié)合反應(yīng)的重要影響因素,這樣做主要是為了使試劑溫度一致,在后面的溫育反應(yīng)步驟中,能使反應(yīng)微孔內(nèi)的溫度能較快地滿足測定要求。

 

Q7

樣本收集后不能及時檢測,低溫保存可以

放多久?

 

A:樣本收集后24之內(nèi)進(jìn)行檢測,放在4℃冰箱即可。如果樣本收集后不能立即檢測,需將樣本置于低溫冰箱中,樣本3個月內(nèi)檢測可于-20℃保存,若需存放時間更久,需要-80℃冰箱保存。

 

Q8

樣品反復(fù)凍融影響大嗎?

 

A:樣品反復(fù)凍融對蛋白影響非常大,能導(dǎo)致蛋白降解,非常不建議反復(fù)凍融樣品。一般蛋白含量豐富的樣本例如血清/血漿反復(fù)凍融1-2次,對于檢測結(jié)果影響不是非常大,但是其他類型的樣本,例如細(xì)胞上清液、肺泡灌洗液,反復(fù)凍融會使蛋白降解嚴(yán)重,對檢測結(jié)果影響非常大。

 

Q9

生物素化抗體和酶結(jié)合物,稀釋后沒用完,

可以再用嗎?

 

A:稀釋后的生物素化抗體和酶結(jié)合物建議在當(dāng)天用完,放置時間太長可能會影響其活性??筛鶕?jù)自己實驗所需用量進(jìn)行配制,不建議過量配制。

 

Q10

變異系數(shù)(CV)較大的原因?

 

A:

Q11

標(biāo)準(zhǔn)曲線較差?

 

A:

 

Q12

高背景或陰性對照值偏高

 

A:

Q13

顯色信號弱

 

A:

 

Q14

無顯色信號

 

A:

 

Q15

標(biāo)曲佳但樣品孔無信號

 

A:

 

索萊寶ELISA試劑盒產(chǎn)品優(yōu)勢 

 

 

精選原料:國外血統(tǒng),多級篩選,品質(zhì);

技術(shù)工藝:專業(yè)制造,嚴(yán)格執(zhí)行全面規(guī)范的SOP;

嚴(yán)格質(zhì)控:批批質(zhì)檢,數(shù)據(jù)真實,可追溯與重復(fù);

種類齊全:400+小物種,500+常見物種,共1000多種;

應(yīng)用廣泛:檢測分析物全面覆蓋癌癥,信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等各領(lǐng)域;

性能:線性范圍廣,高靈敏度,高特異性,高重復(fù)性,高均一性;

品質(zhì):與國外進(jìn)口同類產(chǎn)品平行性高,符合率≥99.95%。

 

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