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細(xì)胞外囊泡（EVs）是細(xì)胞衍生出的膜結(jié)構(gòu)囊泡，如外泌體、微囊泡和凋亡小體等。由于在囊泡腔內(nèi)包裹著或在顆粒表面修飾著豐富的成分，EVs在治療各類危及生命的疾病方面有巨大潛力。通常情況下，源于免疫細(xì)胞外泌體對腫瘤表現(xiàn)出不同的免疫治療效果。另外，由于其天然*的特性，EVs在藥物遞送方面表現(xiàn)出zhuoyue的性能，包括但不限于固有穩(wěn)定性、生物膜透性、低免疫原性和歸巢能力。前人研究證明，裝載阿霉素的外泌體對乳腺癌細(xì)胞有靶向細(xì)胞毒性作用，且與游離藥物相比，心臟毒性和副作用更小。另外一個研究表明，裝載紫杉醇的外泌體對多藥耐藥肺癌有良好的治療效果。外泌體甚至能夠通過血腦屏障遞送藥物，為神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供了可能的解決方案。除了有效的體內(nèi)外實驗結(jié)果外，將外泌體作為藥物載體有著巨大的轉(zhuǎn)化潛力。源于間充質(zhì)干細(xì)胞的外泌體裝載KRAS G12D siRNA后對胰腺癌的治療效果正進(jìn)行Ⅰ期研究。盡管前景廣闊，但它們距離全面臨床轉(zhuǎn)化階段還很遠(yuǎn)。一個最重要的原因就是大多數(shù)EVs由于其納米直徑被保留在網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)中，然后被單核巨噬細(xì)胞和其他細(xì)胞吸收。為了提高藥物遞送精度和減少副作用，在目標(biāo)組織處通過EVs釋放特定藥物非?？扇?，但具有挑戰(zhàn)性。

在過去的幾十年里，光動力療法（PDT）由于其突出的優(yōu)勢，已成為癌癥治療的新模式，比如時空可控性、最小侵入性、高效性和低毒性。該療法已被證實對多種有效，且目前幾種光敏劑已被美國食品和藥物管理局批準(zhǔn)用于治療某些癌癥。此外，該療法與其他治療方法結(jié)合，可進(jìn)一步提高治療效果（比如光熱療法、放射療法、免疫療法和基因療法）。PDT與PDL-1檢查點阻斷免疫療法的協(xié)同作用，不僅可以消除原發(fā)性腫瘤，而且可以觸發(fā)系統(tǒng)性的腫瘤特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)，從而*抑制未治療的轉(zhuǎn)移瘤。即便如此，PDT對深部腫瘤的治療效果受到激發(fā)光透性差、效率低的嚴(yán)重影響。作為一個有吸引力的替代方案，光敏劑通過原位化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生化學(xué)能的激發(fā)不受透性的限制。Yu等通過構(gòu)建基于化學(xué)發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移的仿生納米反應(yīng)器，制定的光動力-饑餓協(xié)同治療策略對深部轉(zhuǎn)移瘤表現(xiàn)出良好的治療效果。然而，由于化學(xué)能通常是H₂O₂與過氧草酸酯衍生物反應(yīng)產(chǎn)生的，此類化學(xué)激發(fā)PDT嚴(yán)重依賴于過氧化氫。盡管與正常組織相比，腫瘤微環(huán)境中的H₂O₂水平升高，但持續(xù)的反應(yīng)會迅速耗盡腫瘤組織局部的H₂O₂供應(yīng)，PDT的治療效果將明顯受限。為了提高化學(xué)激發(fā)的PDT效率，需要在腫瘤微環(huán)境中充分補(bǔ)充H₂O₂。然而，H₂O₂增強(qiáng)劑的可靠性以及增強(qiáng)劑與光敏劑(PSs)共同遞送到腫瘤的有效策略仍然十分有限。

該研究構(gòu)建了自激活自發(fā)光的EVs遞送系統(tǒng)，同時展示三種協(xié)同抗癌治療模式。源于M1巨噬細(xì)胞的EVs（M1 EVs）和雙[2,4,5-三氯-6-（戊氧羰基）苯基]草酸酯（CPPO），二氫卟酚e6（Ce6）共同孵育后，用多柔比星原藥aldoxorubicin（Dox-EMCH）進(jìn)行電轉(zhuǎn)化，以獲得裝載CPPO、Ce6和Dox-EMCH的EVs（M1CCD）。系統(tǒng)給藥后，由于M1 EVs天然的靶向能力，制備的M1CCD在腫瘤中不斷積累，而M1 EVs有效地將促腫瘤的M2巨噬細(xì)胞重新誘導(dǎo)為抗腫瘤的M1巨噬細(xì)胞，不僅表現(xiàn)出免疫治療活性，而且產(chǎn)生H₂O₂。CPPO與增多的H₂O₂反應(yīng)，產(chǎn)生的化學(xué)能在沒有光激發(fā)的情況下直接激活光敏劑Ce6，產(chǎn)生用于成像的化學(xué)發(fā)光和用于PDT的單線態(tài)氧（¹O₂）。與此同時，由¹O₂引起的膜破裂導(dǎo)致前藥Dox-EMCH釋放，隨后在酸性微環(huán)境中被迅速激活轉(zhuǎn)化為毒性阿霉素（Dox），并滲透到腫瘤深部的低氧組織。免疫療法，光動力療法和化學(xué)療法的協(xié)同作用產(chǎn)生了強(qiáng)大的抗癌效果和較小的副作用。這種智能工程化的EV遞送系統(tǒng)作為癌癥治療候選方案非常有前景。

基本信息

摘 要

細(xì)胞外囊泡（EVs）在疾病治療和藥物遞送方面都具有巨大潛力。然而，準(zhǔn)確地從細(xì)胞外囊泡釋放藥物，以及細(xì)胞外囊泡和藥物在目標(biāo)組織處的自發(fā)治療效果協(xié)同作用仍然具有挑戰(zhàn)性。本研究報道了一種工程化的自激活光-EV，用于協(xié)同三模式抗癌治療。M1巨噬細(xì)胞衍生的細(xì)胞外囊泡（M1 EVs）同時裝載CPPO，Ce6和Dox-EMCH。給藥后，由于M1 EVs的腫瘤歸巢能力，制備的該系統(tǒng)可主動靶向腫瘤，其中M1 EVs將M2重新極化為M1巨噬細(xì)胞，不僅顯示出免疫療法的作用，而且進(jìn)一步提高腫瘤微環(huán)境中的H₂O₂。H₂O₂和CPPO之間發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生化學(xué)能，激活Ce6，產(chǎn)生用于成像的化學(xué)發(fā)光和用于PDT的¹O₂。同時，由¹O₂引起的膜破裂導(dǎo)致Dox-EMCH釋放，被釋放的Dox-EMCH隨后被特異性激活并滲透到腫瘤的低氧組織。免疫療法，光動力療法和化學(xué)療法的協(xié)同作用可產(chǎn)生有效的抗癌功效，顯示出抗擊癌癥的巨大希望。

研究內(nèi)容及結(jié)果

1. M1CCD具有自激活化學(xué)發(fā)光和¹O₂生成能力

小鼠原始腹腔巨噬細(xì)胞首先用1ug/mL脂多糖（LPS）處理24小時極化形成M1巨噬細(xì)胞，通過流式細(xì)胞術(shù)確定極化效果。隨后用經(jīng)驗證的超速離心程序純化M1 EVs。EVs的磷脂雙分子層通過疏水作用將CPPO和Ce6包裹起來，形成的親水管腔裝載水溶性的Dox-EMCH。為了裝載盡可能多的藥物，首先，作者分別研究了M1 EVs（約10¹⁰細(xì)胞顆粒mL^-1）中CPPO、Ce6和Dox-EMCH的裝載能力，發(fā)現(xiàn)裝載飽和濃度分別為100、160和250 ug/mL。然后將相同數(shù)目的M1 EVs（約10¹⁰細(xì)胞顆粒mL^-1）用100 ug/mL的CPPO和160 ug/mL的Ce6孵育，用250 ug/mL的Dox-EMCH進(jìn)行電轉(zhuǎn)化。通過CPPO、Ce6和Dox-EMCH紫外吸收光譜的特征吸收峰及其標(biāo)志物的熒光成像效果驗證這些藥物是否成功裝載（圖2a,b）。每1×10¹⁰M1 EVs顆粒（n=6）CPPO、Ce6和Dox-EMCH的裝載量分別為16.7±0.8,5.4±0.3,12.7±0.5ug。與原始M1 EVs相似，M1CCD的形態(tài)為典型的杯狀（圖2c），且裝載藥物后其Zeta電位幾乎不變。M1CCD的水動力學(xué)尺寸為165±31nm（n=6），與原始M1 EVs相比增加了約36nm。M1CCD可在鹽酸鹽緩沖液（PBS）或10%胎牛血清中保存一周，顯示出良好的穩(wěn)定性（圖2d，e）。

為實現(xiàn)化學(xué)激發(fā)的光動力療法，有必要確定光敏劑的分子最高占據(jù)軌道（HOMO）與化學(xué)激發(fā)源的分子低占據(jù)軌道（LUMO）間的電子轉(zhuǎn)移。對M1CCD來說，Ce6為光敏劑，CPPO與H₂O₂反應(yīng)的中間產(chǎn)物1,2-二氧雜環(huán)丁烷二酮為化學(xué)激發(fā)源。通過Gaussian 09計算，Ce6的分子最高占據(jù)軌道能和1,2-二氧雜環(huán)丁烷二酮的分子低占據(jù)軌道能分別為-5.23和-3.20eV。這個2.03eV的能量差足夠CPPO直接激發(fā)Ce6，反應(yīng)產(chǎn)生化學(xué)熒光（圖2f）。在H₂O₂存在的情況下，不同形式M1 EV化學(xué)熒光圖像表明M1 EVs、裝載CPPO的M1 EVs（M1@CPPO）和裝載Ce6的M1 EVs幾乎都沒有這種熒光信號。然而，M1CCD和同時裝載CPPO、Ce6的M1 EVs（M1CC）可以產(chǎn)生特定化學(xué)熒光，這證實Ce6只有在CPPO和H₂O₂的作用下才可以被激發(fā)。在M1CCD一定的情況下，化學(xué)熒光強(qiáng)度與H₂O₂濃度呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。因此，這能夠用于追蹤小鼠腹膜炎不同發(fā)展階段的情況。同時，受激發(fā)的Ce6通過系統(tǒng)間交叉（ISC）將一些電子轉(zhuǎn)移給分子氧，產(chǎn)生用于PDT的化學(xué)熒光產(chǎn)物¹O₂。

2. M1CCD能有效地將M2巨噬細(xì)胞重新極化為M1表型

巨噬細(xì)胞一般分為2種類型：抗腫瘤M1細(xì)胞和促腫瘤M2細(xì)胞，而大多數(shù)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAMs）屬于免疫抑制型M2巨噬細(xì)胞。幸而，M1 EVs能夠不斷將M2巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化成M1巨噬細(xì)胞，不僅可以吞噬腫瘤細(xì)胞，而且可以有效地產(chǎn)生包括H₂O₂在內(nèi)的活性氧（ROS），以便于CPPO順利激活Ce6。為了確定M1CCD的重極化能力，將PBS（空白對照）、來自巨噬細(xì)胞的原始EVs（M0 EVs，陰性對照）、M1 EVs、M1CCD和LPS（陽性對照）分別與M2巨噬細(xì)胞孵育24小時。正如預(yù)期的是，經(jīng)M1 EVs處理的細(xì)胞中M1協(xié)同刺激因子CD86（圖3a）和抗腫瘤炎癥因子IL-6、TNF-α（圖3b）的表達(dá)顯著提高，而M2巨噬細(xì)胞典型標(biāo)志物CD206的表達(dá)降低，這表明M2巨噬細(xì)胞成功轉(zhuǎn)化為M1巨噬細(xì)胞。值得注意的是M1CCD的重極化能力與M1 EVs和LPS相當(dāng)。結(jié)果顯示，M1 EVs、M1CCD和LPS處理組的H₂O₂濃度顯著增加，M1CCD處理組的H₂O₂濃度相對較低可能是由于被CPPO迅速消耗（圖3c）。近期，細(xì)胞形態(tài)的變化被視為巨噬細(xì)胞極化的可靠特征。作者也發(fā)現(xiàn)M2巨噬細(xì)胞形態(tài)較長，但是經(jīng)M1CCD處理后細(xì)胞呈餅狀。為了進(jìn)一步研究M1CCD是否能夠提高重極化巨噬細(xì)胞的吞噬能力，將經(jīng)過不同處理的用CFSE標(biāo)記的4T1腫瘤細(xì)胞與M2巨噬細(xì)胞共同孵育。隨后，巨噬細(xì)胞用PE標(biāo)記抗小鼠CD11b抗體染色，用激光共聚焦掃描顯微鏡（CLSM）成像。如圖3d所示，經(jīng)PBS和M0 EVs處理的M2巨噬細(xì)胞無法吞噬4T1腫瘤細(xì)胞，與之相反的是，經(jīng)M1CCD、M1 EVs和LPS處理的M2巨噬細(xì)胞幾乎吞噬了全部的4T1腫瘤細(xì)胞。結(jié)果顯示，M1CCD處理組中85.3%的巨噬細(xì)胞PE染色和CFSE染色均呈陽性?？傊?，以上結(jié)果證明，M1CCD能夠有效地重編程M2巨噬細(xì)胞，產(chǎn)生H₂O₂，為光動力療法和免疫療法提供可行性。

 3.在M1 EVs中，CPPO和Ce6執(zhí)行有效的PDT作用，并促進(jìn)Dox-EMCH的釋放

在這個化學(xué)激活的光動力療法系統(tǒng)中，CPPO與H₂O₂反應(yīng)產(chǎn)生高能中間產(chǎn)物-1,2-二氧雜環(huán)丁烷二酮，然后激活Ce6，將電子轉(zhuǎn)移給分子氧，產(chǎn)生¹O₂。對應(yīng)的，¹O₂的產(chǎn)生與H₂O₂的濃度緊密相關(guān)。與正常細(xì)胞相比，腫瘤細(xì)胞通常產(chǎn)生更多的H₂O₂。為了估計腫瘤細(xì)胞相對正常細(xì)胞化學(xué)激活的¹O₂的產(chǎn)出，用PBS、M1@CPPO、M1@Ce6和M1CC分別處理4T1細(xì)胞和J774A.1細(xì)胞，用2',7'-二氯二氫熒光素（DCFH-DA）檢測¹O₂的生成量。同預(yù)期一樣，所有J774A.1細(xì)胞處理組均出現(xiàn)輕微的¹O₂熒光信號，經(jīng)PBS、M1@CPPO和M1@Ce6處理的4T1細(xì)胞也出現(xiàn)輕微的熒光信號，但M1CC處理組顯示出更亮的熒光信號，強(qiáng)度是PBS對照組的20倍。上述結(jié)果表明，由于激活狀態(tài)Ce6的存在，¹O₂在H₂O₂充足的腫瘤細(xì)胞中可以特定地產(chǎn)出。因此，M1CC對正常細(xì)胞影響很小，而對4T1細(xì)胞有明顯的細(xì)胞毒性，且呈劑量依賴性。而且，添加H₂O₂能夠進(jìn)一步增強(qiáng)細(xì)胞毒性。具體來說，經(jīng)每毫升6.4×10⁹顆粒的M1CC處理后，4T1細(xì)胞活力為43%，而添加100×10^-6M H₂O₂后，細(xì)胞活力降到14%（圖4a）。考慮到腫瘤微環(huán)境中存在許多M2巨噬細(xì)胞，且M1 EVs能夠?qū)2巨噬細(xì)胞重極化為M1巨噬細(xì)胞，而使H₂O₂濃度明顯增加，作者用一個體外Transwell模型進(jìn)一步研究了M1CC誘導(dǎo)的4T1細(xì)胞凋亡。在該模型中，M2巨噬細(xì)胞在腔體頂部孵育，4T1細(xì)胞在腔體底部（圖4b）。然后，將PBS、裝載CPPO和Ce6的M0 EVs（M0CC）、M1CC分別加到模型的頂部和底部，孵育48小時以使頂部的M2巨噬細(xì)胞重極化為M1巨噬細(xì)胞，誘導(dǎo)底部PDT的化學(xué)激活。最后，用流式細(xì)胞術(shù)分析4T1細(xì)胞活力發(fā)現(xiàn)，M0CC處理后4T1細(xì)胞的凋亡總量為57.9%，M1CC處理組細(xì)胞凋亡量達(dá)76%，這表明，M1CC在特定的腫瘤微環(huán)境中能夠展現(xiàn)出對PDT有效的影響。

M1 EVs可以提高腫瘤微環(huán)境中的H₂O₂含量，進(jìn)而增強(qiáng)化學(xué)激活PDT的效果。但這毫無疑問會受到腫瘤深處缺氧狀態(tài)和納米EVs低滲透性的限制。鑒于小分子藥物具有強(qiáng)滲透性這一可行性，因此將化學(xué)療法納入到系統(tǒng)中進(jìn)一步提高療效。Dox-EMCH是源自阿霉素的腙類物質(zhì)，分子中對酸敏感的腙連接體在微酸環(huán)境能夠釋放阿霉素。因此，在體外（包括人類）腫瘤微環(huán)境的pH6.5下，它展現(xiàn)出強(qiáng)烈的細(xì)胞毒性，但在pH7.4時對細(xì)胞影響較小。多細(xì)胞球（MCSs）模型結(jié)果明確表明，游離Dox-EMCH能夠滲透到腫瘤組織深處。相反的是，與其他小分子相比，裝載到M1 EVs中的Dox-EMCH（M1D）由于EVs巨大的體積使其滲透能力大大降低。有趣的是，與M1D相比，裝載到M1CCD中的Dox-EMCH的滲透深度顯著恢復(fù)，這可能是因為M1CCD能夠在MCSs中有效地產(chǎn)生¹O₂，誘導(dǎo)M1 EVs胞膜破裂，釋放Dox-EMCH（圖4d）。

4. M1CCD主動靶向腫瘤組織并顯示出有效的治療功效

將4T1腫瘤模型小鼠分為9組，分別用不同制劑治療，包括PBS、M1 EVs、Dox、M0CC、M0D、M1CC、M1D、M0CCD和M1CCD（圖5a）。如圖5b所示，M1 EVs和Dox輕微抑制腫瘤的生長，小鼠最終在21天內(nèi)死亡。與M1 EVs、M0CC和M0D相比，由于免疫療法與光動力療法或者免疫療法與化學(xué)療法的協(xié)同作用，M1CC、M1D和M0CCD明顯抑制了腫瘤的發(fā)育。值得注意的是，M1CCD處理組的腫瘤幾乎被*抑制，40天觀察期內(nèi)的存活率為100%（圖5c）。不同處理組腫瘤平均重量也證明M1CCD的抗腫瘤效果好（圖5d）。M1CCD的腫瘤抑制率（以腫瘤體積計算）為91.6%，遠(yuǎn)高于M1 EVs（17%）、M1CC（61%）和M1D（70%）（圖5e）。另外，H&E和Ki67染色結(jié)果表明，M1CCD處理組促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞增生的能力*（圖5f）。

結(jié) 論

作者通過將CPPO、Ce6和Dox-EMCH裝載到M1 EVs中，構(gòu)建自激活的光-胞外囊泡，用于協(xié)同三模態(tài)抗癌治療。給藥后，獲得的M1CCD能夠通過M1 EVs天然的腫瘤歸巢能力主動靶向腫瘤。因此，免疫療法，光動力療法和化學(xué)療法以自激活和相互協(xié)同的方式，通過M1CCD與特殊的腫瘤微環(huán)境的相互作用，產(chǎn)生強(qiáng)大的抗癌效果和較小的副作用。未來研究團(tuán)隊將繼續(xù)開發(fā)抗癌效果更好的治療策略，比如增強(qiáng)M1 EVs的特定靶向能力，開發(fā)化學(xué)發(fā)光效率和PDT效應(yīng)更強(qiáng)的新型光敏劑。

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