文獻(xiàn)背景
結(jié)直腸癌（CRC）是世界上常見和第二致命的惡性腫瘤。其中，70%以上的CRC死亡率由CRC肝轉(zhuǎn)移（CRCLM）引起。血管生成抑制劑貝伐單抗常用于CRCLM的治療。然而，內(nèi)源性和獲得性耐藥性經(jīng)常發(fā)生，導(dǎo)致治療失敗和癌癥復(fù)發(fā)。CRCLM主要包含三種不同的組織病理學(xué)生長模式（HGP）：促結(jié)締組織增生型（DHGP）、推進(jìn)型（PHGP）和替換型（RHGP）。這些生長模式具有不同的組織病理學(xué)特征，并利用不同的方式獲得血管供應(yīng)。DHGP和PHGP以血管生成為腫瘤的主要供血方式。對于RHGP，腫瘤細(xì)胞浸潤肝薄壁的肝板并綁架已經(jīng)存在的竇狀血管，這稱為血管劫持。血管劫持被認(rèn)為是介導(dǎo)CRCLM抗血管生成治療耐藥的重要機(jī)制，但其分子機(jī)制尚不清楚。目前，一些研究主要集中于“劫持者"腫瘤細(xì)胞方向，“被劫持者"血管基質(zhì)細(xì)胞（竇狀毛細(xì)血管）對血管劫持的作用機(jī)制仍然未知。
肝星狀細(xì)胞（HSC）在CRCLM的病理過程中起著關(guān)鍵作用。CRC細(xì)胞分泌多種生長因子，包括轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β），以激活HSC，HSC反過來分泌趨化因子、細(xì)胞因子、生長因子或蛋白酶，以促進(jìn)腫瘤生長、轉(zhuǎn)移、血管生成和免疫逃逸。從HSC的角度闡明血管劫持的分子機(jī)制將為新的靶向治療策略提供線索，以克服血管劫持介導(dǎo)的抗血管生成藥物的耐藥性。
成纖維細(xì)胞活化蛋白α（FAPα）是一種II型整合型膜絲氨酸蛋白酶，具有內(nèi)肽酶活性，能夠特異性切割N-末端芐氧羰基阻斷（Z阻斷）Gly-Pro（Z-GP）二肽連接底物。其特殊的二肽底物水解活性及其在腫瘤微環(huán)境中的限制表達(dá)使其成為酶激活前藥物策略的理想靶點。用FAPα激活的前體藥物Z-GP-DAVLBH靶向FAPα+HSC有效克服了血管劫持介導(dǎo)的CRCLM抗血管生成治療的耐藥性。
基本信息
摘要
血管劫持已被證明可介導(dǎo)結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移（CRCLM）對抗血管生成治療的耐藥性。目前血管劫持機(jī)制的研究主要集中在“劫持者"腫瘤細(xì)胞本身的變化，而“被劫持者"竇狀毛細(xì)血管的功能尚未探索。在這里，作者發(fā)現(xiàn)對貝伐單抗耐藥的CRCLM異種移植物中血管劫持的發(fā)生與肝星狀細(xì)胞（HSC）中成纖維細(xì)胞活化蛋白α（FAPα）的表達(dá)增加有關(guān)，在攜帶CRCLM同種異體移植物的HSC特異性條件FAP敲除小鼠中，F(xiàn)APα的表達(dá)顯著減弱。從機(jī)制上講，貝伐單抗治療可誘導(dǎo)缺氧上調(diào)腫瘤細(xì)胞中成纖維細(xì)胞生長因子結(jié)合蛋白1（FGFBP1）的表達(dá)。功能獲得或喪失實驗表明，貝伐單抗耐藥腫瘤細(xì)胞來源的FGFBP1通過增強(qiáng)HSC旁分泌FGF2-FGFR1-ERK1/2EGR1信號通路誘導(dǎo)FAPα表達(dá)。FAPα促進(jìn)HSC中CXCL5的分泌，從而激活CXCR2，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）和髓源性抑制細(xì)胞（MDSC）的募集。這些發(fā)現(xiàn)在CRCLM患者來源的腫瘤組織中得到了進(jìn)一步驗證。以FAPα+HSC為靶點有效地破壞了被劫持的竇狀毛細(xì)血管，克服了貝伐單抗的耐藥性。作者的研究強(qiáng)調(diào)了FAPα+HSC在血管劫持中的作用，并為克服血管劫持介導(dǎo)的貝伐單抗耐藥性提供了有效策略。
研究內(nèi)容及結(jié)果
1.FAPα在貝伐單抗耐藥的CRCLM異種移植模型被劫持竇狀毛細(xì)血管的HSC中的表達(dá)
貝伐單抗敏感的HCT116 CRCLM異種移植模型小鼠給予貝伐單抗（10 mg/kg）處理42天生成獲得性耐藥模型。貝伐單抗固有耐藥HT-29異種移植模型用貝伐單抗（10 mg/kg）治療12天，以確認(rèn)耐藥情況（圖1A）。
結(jié)果顯示，空白組中HGP主要是DHGP和PHGP，耐藥組腫瘤則以RHGP為主要形式（圖1B）。同時，貝伐單抗獲得性耐藥HCT116 CRCLM異種移植模型中被劫持竇狀毛細(xì)血管的數(shù)量顯著高于空白組（圖1C）。耐藥組中被劫持竇狀毛細(xì)血管的αSMA+HSC中均顯示出FAPα染色。癌旁正常肝組織的HSC或CRCLM異種移植物中心區(qū)域的新生微血管中均未出現(xiàn)FAPα和αSMA染色（圖1D）。
圖1
2.FAPα誘導(dǎo)HSC分泌CXCL5以促進(jìn)血管劫持
將具有貝伐單抗固有耐藥性的MC38小鼠結(jié)腸腺癌細(xì)胞系直接注射到Fap野生型小鼠（Fapfl/fl）或HSC特異性條件Fap敲除小鼠（FapΔGfap）的肝實質(zhì)，以生成固有貝伐單抗耐藥的CRCLM同種移植物（圖2A）。
結(jié)果表明，與Fapfl/fl小鼠相比，F(xiàn)apΔGfap小鼠的被劫持竇狀毛細(xì)血管顯著減少（圖2，B和C）。作者推測FAPα+HSC可能預(yù)先建立免疫抑制微環(huán)境并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞EMT促進(jìn)血管劫持。與推測相符，Gr-1+MDSCs的募集被顯著抑制（圖2D），CD8+T細(xì)胞的出現(xiàn)顯著增加（圖2E），間充質(zhì)標(biāo)記物波形蛋白和N-神經(jīng)鈣粘附蛋白的表達(dá)降低，上皮標(biāo)記物E-鈣黏蛋白的表達(dá)增加（圖2F）。
圖2
為了進(jìn)一步研究FAPα在HSC調(diào)控的血管劫持中的機(jī)制，作者生成了FAPα穩(wěn)定過表達(dá)的人肝星狀細(xì)胞系LX-2和陰性對照細(xì)胞（LX-2Vector）。結(jié)果表明，F(xiàn)APα穩(wěn)定過表達(dá)可提高編碼分泌因子CSF2、IL18、CXCL5、IL33、IL1B和IL16的基因水平（圖3A），CXCL5是很顯著的上調(diào)基因（圖3B）。ELISA檢測表明，LX-2FAP細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的CXCL5水平明顯高于LX-2Vector細(xì)胞（圖3C）。
鑒于腫瘤來源的CXCL5通過激活CXCR2促進(jìn)腫瘤細(xì)胞EMT和MDSC募集，作者提出HSC來源的FAPα通過CXCL5-CXCR2軸促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的EMT和MDSC招募。作者發(fā)現(xiàn)，LX-2FAP細(xì)胞的條件化培養(yǎng)基可刺激MDSCs和HCT116細(xì)胞內(nèi)Ca2+動員的快速和短暫增加，增強(qiáng)了MDSC的遷移，促進(jìn)了HCT116細(xì)胞的遷移和侵襲，增加了波形蛋白、N-鈣粘蛋白和snail的表達(dá)，并降低了HCT116細(xì)胞中E-鈣粘蛋白的表達(dá)（圖3，E-G）。CXCL5中和抗體或SB225002（CXCR2抑制劑）可顯著減弱這些效應(yīng)（圖3，D-G）。證實了FAPα誘導(dǎo)HSC分泌CXCL5，通過激活CXCR2促進(jìn)腫瘤細(xì)胞EMT和MDSC的招募，從而促進(jìn)血管的劫持作用。
圖3
3.腫瘤細(xì)胞來源的FGFBP1誘導(dǎo)HSC中FAPα的表達(dá)以促進(jìn)血管劫持
蛋白質(zhì)組學(xué)分析表明，在貝伐單抗耐藥腫瘤中發(fā)現(xiàn)了17種上調(diào)蛋白（圖4A）。FGFBP1水平為很顯著的上調(diào)基因，且表達(dá)量顯著高于空白組（圖4，B-D）。
在FGFBP1低表達(dá)HCT116細(xì)胞上建立FGFBP1過表達(dá)細(xì)胞系，在FGFBP1高表達(dá)HT-29細(xì)胞上建立FGFBP1抑制細(xì)胞系。結(jié)果表明，F(xiàn)GFBP1過表達(dá)可提高RHGP比率，而FGFBP1抑制表達(dá)可降低RHGP比率（圖4E）。同樣的，F(xiàn)GFBP1過表達(dá)組中被劫持竇狀毛細(xì)血管的數(shù)量及HSCs中FAPα的表達(dá)均顯著高于FGFBP1抑制組（圖4F和G）。此外，F(xiàn)GFBP1過表達(dá)組中的MDSC的募集和腫瘤細(xì)胞EMT也更顯著。綜上所述，表明腫瘤細(xì)胞來源的FGFBP1誘導(dǎo)HSC中FAPα的表達(dá)并促進(jìn)血管劫持。
圖4
4.腫瘤細(xì)胞來源的FGFBP1通過FGF2-FGFR1-ERK1/2-EGR1軸誘導(dǎo)HSC中FAPα的表達(dá)
FGFBP1可以通過從細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）釋放FGF2來增強(qiáng)FGFR1信號的激活。作者提出HSC中FGFR1激活誘導(dǎo)的FAPα的表達(dá)可能受ERK1/2-GGR1軸調(diào)控。結(jié)果表明，使用FGFBP1過表達(dá)細(xì)胞的條件培養(yǎng)基處理的LX-2細(xì)胞中FGFR1和ERK1/2的磷酸化以及EGR1和FAPα的表達(dá)顯著增加（圖5A）。FGF2和FGFR1的抑制可顯著減弱上述作用（圖5，A和B）。此外，LY3214996（ERK1/2特異性抑制劑）治療顯著抑制了EGR1和FAPα的表達(dá)（圖5C），而抑制EGR1顯著降低了FAPα的表達(dá)（圖5D）。
體內(nèi)實驗還表明，F(xiàn)GF2中和抗體或PD-166866（FGFR1特異性抑制劑）顯著抑制FGFBP1過表達(dá)CRCLM異種移植物HSC中p-FGFR1、p-ERK1/2、EGR1和FAPα的表達(dá)（圖5G和補(bǔ)充圖8A）。這些數(shù)據(jù)表明，腫瘤細(xì)胞來源的FGFBP1通過FGF2-FGFR1-ERK1/2-EGR1軸誘導(dǎo)HSC中FAPα的表達(dá)。
圖5
5.貝伐單抗通過激活HSC中的FGF2-FGFR1-FAPα-CXCL5軸誘導(dǎo)血管劫持
貝伐單抗與FGF2中和抗體或PD-166866的聯(lián)合應(yīng)用顯著抑制了貝伐單抗耐藥HCT116和HT-29CRCLM異種移植物的腫瘤生長，并降低了MVD。同時也顯著降低了RHGP的比率（圖6A和補(bǔ)充圖10A）和被劫持竇狀毛細(xì)血管的數(shù)量（圖6B和補(bǔ)充圖10 B）。FGF2中和抗體和PD-166866均抑制HSC中p-FGFR1和FAPα的表達(dá)水平（圖6C和補(bǔ)充圖10C），抑制Gr-1+MDSC的募集（圖6D和補(bǔ)充圖10D），降低波形蛋白的表達(dá)，并增加腫瘤細(xì)胞中E-鈣黏蛋白的表達(dá)（補(bǔ)充圖10E）。這些數(shù)據(jù)表明，貝伐單抗通過激活FGFR1-FAPα軸促進(jìn)腫瘤細(xì)胞EMT和MDSC募集而誘導(dǎo)血管劫持作用。
ELISA分析表明，F(xiàn)GFR1的抑制可顯著降低CXCL5的表達(dá)（圖6E），并且抑制了MDSC的遷移和HCT116細(xì)胞的遷移和侵襲（圖6、F和G以及補(bǔ)充圖11B），降低了波形蛋白、N-鈣粘蛋白和snail的表達(dá)，增加了HCT116中E-鈣粘蛋白的表達(dá)（圖6H和補(bǔ)充圖11C）。然而，F(xiàn)APα的過度表達(dá)完整挽救了這些抑制作用（圖6E-H）。這些發(fā)現(xiàn)表明，F(xiàn)GFR1激活可能依賴于FAPα誘導(dǎo)HSC分泌CXCL5，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞EMT和MDSC募集，從而促進(jìn)血管劫持。
圖6
6.貝伐單抗誘導(dǎo)的HSC中FAPα表達(dá)與CRCLM患者的血管劫持作用相關(guān)
如CRCLM患者的CT掃描所示（圖7A），術(shù)前化療聯(lián)合貝伐單抗（Chemo+Bev）組治療的患者DHGP或PHGP的病灶形態(tài)顯著轉(zhuǎn)化為RHGP，但單用化療（Chemo）組的病灶形態(tài)不明顯。組織病理學(xué)檢查顯示，DHGP和PHGP主要存在于Chemo的患者中，而Chemo+Bev治療的患者主要含有RHGP（圖7B）。
Chemo+Bev治療的患者腫瘤中FGFBP1的表達(dá)比Chemo治療的患者更強(qiáng)（圖7C）。Chemo+Bev治療患者被劫持竇狀毛細(xì)血管和FAPα+HSC的數(shù)量增多（圖7D），并且顯示出更高的p-FGFR1水平（圖7E）。此外，在CRCLM患者中，F(xiàn)APα+HSC的數(shù)量與FGFBP1表達(dá)、被劫持竇狀毛細(xì)血管或RHGP呈正相關(guān)（圖7F）。患有RHGP的CRCLM患者對貝伐單抗的反應(yīng)較差，這可以從接受Chemo+Bev治療的患者的腫瘤負(fù)荷增加（與接受Chemo治療的患者相似）得到證明（圖7G）。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明貝伐單抗治療導(dǎo)致FGFBP1-FGFR1-FAPα軸激活，這可能是血管劫持介導(dǎo)貝伐單抗耐藥性的原因。
圖7
7.以FAPα+HSC為靶點破壞被劫持的竇狀毛細(xì)血管以克服貝伐單抗耐藥性
接下來，作者研究了利用Z-GP-DAVLBH（作者實驗室合成的一種FAPα激活前體藥物）在被劫持竇狀毛細(xì)血管中以FAPα+HSC為靶點是否可以消除貝伐單抗誘導(dǎo)的血管劫持。結(jié)果表明，Z-GP-DAVLBH治療在貝伐單抗耐藥的HCT116和HT-29CRCLM異種移植物中均誘導(dǎo)腫瘤消退，如增加壞死面積（圖8，A和B）和腫瘤組織中MVD減少（補(bǔ)充圖12A）。
從機(jī)制上講，Z-GP-DAVLBH治療逆轉(zhuǎn)了RHGP的發(fā)展（圖8，A和B），減少了被劫持竇狀毛細(xì)血管的數(shù)量（圖8C），阻止了Gr-1+MDSC的募集，抑制了腫瘤細(xì)胞EMT。此外，還破壞了被劫持竇狀毛細(xì)血管，導(dǎo)致肝臟腫瘤界面出血（補(bǔ)充圖12E）。這種效應(yīng)可能與Z-GP-DAVLBH誘導(dǎo)的被劫持竇狀毛細(xì)血管中FAPα+HSC細(xì)胞凋亡有關(guān)（圖8D）。最終，Z-GP-DAVLBH延長了HT-29和HCT116CRCLM異種移植小鼠的總存活時間（圖8E）。這些數(shù)據(jù)表明，Z-GP-DAVLBH選擇性誘導(dǎo)FAPα+HSC凋亡，破壞被劫持竇狀毛細(xì)血管，并克服血管劫持介導(dǎo)的貝伐單抗治療耐藥性。
圖8
結(jié)論
血管劫持是一種非血管生成依賴性現(xiàn)象，常見于肝癌、肺癌、腎癌和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。越來越多的證據(jù)表明，血管劫持在介導(dǎo)抗血管生成治療耐藥中起著重要作用。目前，血管劫持的研究主要集中在“劫持者"腫瘤細(xì)胞上，而克服治療耐藥性的有效策略仍然缺乏。令人驚訝的是，“被劫持者"血管基質(zhì)細(xì)胞在血管劫持中的作用在很大程度上仍然未知。在此，作者從“被劫持者"角度闡明了血管劫持的潛在機(jī)制，并揭示了克服血管劫持介導(dǎo)的CRCLM抗血管生成治療耐藥性的有效策略。貝伐單抗治療誘導(dǎo)HSC中FAPα的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞EMT和MDSC的募集，進(jìn)而顯著促進(jìn)血管劫持。阻斷FGFBP1-FGF2-FGFR1信號通路可抑制HSC中FAPα的表達(dá)，并減弱血管劫持，F(xiàn)APα激活前藥Z-GP-DAVLBH靶向FAPα+HSC可破壞被劫持竇狀毛細(xì)血管，從而消除血管劫持，有效地克服了血管劫持介導(dǎo)的CRCLM對抗血管生成治療的耐藥性，為其提供了潛在的治療策略和藥物候選。
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