文獻背景
約50%-60%的臨床癌癥患者接受單獨放療或與手術(shù)、化療、靶向治療和免疫治療等其他治療方式聯(lián)合治療。越來越多的數(shù)據(jù)表明，輻射治療不僅可以造成不可修復(fù)的DNA損傷，直接殺死癌細胞，還可以產(chǎn)生大量的自由基(如活性氧，ROS)，誘導(dǎo)癌細胞的免疫原性細胞死亡(ICD)，引發(fā)強烈的抗腫瘤免疫反應(yīng)。
目前，已經(jīng)開發(fā)了多種放射增敏劑或輔助劑，通過加速DNA損傷、產(chǎn)生自由基、重塑腫瘤基質(zhì)或抗腫瘤免疫，增強放療的治療反應(yīng)。然而，由于實體腫瘤細胞外基質(zhì)網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜，且具有時空異質(zhì)性，使得這些藥物在藥物溶液中給藥，甚至裝入納米載具時，都很難被遞送到各種有害細胞中。此外，常用的納米載具通常被困在腫瘤血管周圍，無法穿過致密的腫瘤間質(zhì)擴散到遠處的缺氧區(qū)，導(dǎo)致改善腫瘤氧合和增強對放射治療反應(yīng)的效果不佳。除了同源靶向作用外，癌細胞還可以通過細胞外微泡或外泌體靈活地與腫瘤相關(guān)成纖維細胞(CAFs是腫瘤間質(zhì)的主要細胞成分，在所有階段的癌癥發(fā)展中發(fā)揮核心作用)進行通信，促進腫瘤進展，從而為腫瘤放療提供了一個令人鼓舞的傳遞平臺。
納米體系的供氧能力在很大程度上取決于兩親性聚氟碳化合物材料中的氟源、與其他輔助成分的有效結(jié)合以及納米體系的結(jié)構(gòu)。在之前的報道中，發(fā)現(xiàn)基于F11或F15的氟源對改善腫瘤氧合是有效的。此外，用紅細胞膜掩蓋全氟碳化合物納米系統(tǒng)可以提高腫瘤組織中的氧含量。在此基礎(chǔ)上，合成了F15氟源的聚氟碳，開發(fā)了一種微囊泡激發(fā)的M-FDH納米系統(tǒng)，該系統(tǒng)可以結(jié)合全氟碳化合物的氧傳遞能力和癌細胞膜的生物激發(fā)特性，從而改善腫瘤的氧合，并在放射治療時產(chǎn)生活性氧(ROS)，用于聯(lián)合癌癥治療。
基于這一觀點，設(shè)計了一種癌細胞仿微泡型氧氣遞送聚氟碳納米系統(tǒng)，該系統(tǒng)加載了射頻敏化劑DiIC18(5) (DiD)和抗纖維化劑氟化酮(HF) (M-FDH)，以改善腫瘤內(nèi)傳遞和緩解腫瘤hyp(5)缺氧，從而協(xié)同輻射增強抗癌效果。改造腫瘤基質(zhì)，增強抗腫瘤免疫，進行聯(lián)合治療(方案1)。
方案1
基本信息
摘要
腫瘤中強烈的缺氧、復(fù)雜的間質(zhì)和抑制性免疫微環(huán)境對放療的療效構(gòu)成了極大的挑戰(zhàn)。為此，設(shè)計了一種負載DiIC18(5)和氟化酮(M-FDH)的微泡賦氧聚氟化碳納米體系，該體系具有顯著的改善腫瘤氧合和瘤內(nèi)分布、協(xié)同輻射破壞腫瘤基質(zhì)、提高抗腫瘤免疫的能力，可用于聯(lián)合癌癥治療。M-FDH可使腫瘤氧化增強10.98倍，并在輻射時產(chǎn)生活性氧(ROS)。M-FDH + X射線治療導(dǎo)致顯著的DNA損傷，超過90%的腫瘤相關(guān)成纖維細胞(CAFs)和細胞外基質(zhì)的主要成分消除，顯著增強腫瘤殺傷CD3+CD8+ T細胞，發(fā)現(xiàn)消除4T1腫瘤中的抑制性免疫細胞。M-FDH + X射線抑制腫瘤生長的療效在兩種小鼠腫瘤模型中得到證實。因此，本研究提供了一種令人鼓舞的微囊啟發(fā)策略，靶向腫瘤中的癌細胞和CAFs，協(xié)同放射治療有效治療癌癥。
研究內(nèi)容及結(jié)果
1. M-FDH的表征
在本設(shè)計中，F(xiàn)PP作為腫瘤氧合的載氧材料，DiD作為放射增敏劑，在放療時產(chǎn)生ROS， HF由于其基質(zhì)消耗和免疫調(diào)節(jié)作用而被選擇。這些疏水治療藥物可以裝載在納米結(jié)構(gòu)的內(nèi)部疏水核心，在FDH中，DiD和HF的EE值分別為99.02±1.95%和92.80±1.00%，在M-FDH中，DiD和HF的EE值分別為97.61±2.74%和90.06±1.20%。這些數(shù)據(jù)揭示了疏水DiD和HF在FDH和M-FDH體系中的高效封裝。當(dāng)它們在PBS (pH值7.4)和全都FBS中孵育24小時時，這兩種納米配方中只釋放少量DiD和HF(圖1A-B)。在PBS (pH7.4)或FBS中孵育24 h后，90%以上的DiD和HF仍保留在FDH中，85%以上的DiD和HF仍保留在M-FDH中，表明它們在模擬生理液中具有良好的穩(wěn)定性和體內(nèi)傳遞的可行性。
隨后，檢測了M-FDH的溶氧能力以及它們在X射線輻射下產(chǎn)生ROS的能力。測量結(jié)果表明，預(yù)氧化M-FDH和FDH中的氧濃度明顯高于未處理的溶液(圖1F)。測量結(jié)果有效地證實了預(yù)氧化M-FDH產(chǎn)生ROS的能力(圖1G)?？紤]到輻射處理時ROS的顯著產(chǎn)生，我們測量了它們對FDH或M-FDH釋放HF的影響，在6 Gy的輻射下，F(xiàn)DH和M-FDH分別釋放了69.13%和84.81%的HF，表明這兩種納米系統(tǒng)在輻射處理后藥物釋放顯著。因此，M-FDH系統(tǒng)表現(xiàn)出了顯著的供氧能力、高效的ROS生成活性和顯著的藥物釋放，具有改善放療反應(yīng)的巨大潛力。
圖1 M-FDH的表征
2. 癌細胞體外細胞攝取及誘導(dǎo)ICD的療效
通過流式細胞儀檢測從4T1乳腺癌腫瘤中分離出的4T1癌細胞和原發(fā)性CAFs中M-FDH的細胞攝取與FDH的比較。與FDH相比，M-FDH優(yōu)先被4T1癌細胞和CAFs吸收(圖2A)，這主要是由于M-FDH系統(tǒng)具有模擬癌細胞微泡的特性。細胞毒性分析表明，游離HF、FDH和M-FDH治療及其聯(lián)合放療對4T1癌細胞的活性具有顯著的濃度依賴性抑制作用，但游離DiD對4T1癌細胞的細胞毒性可忽略不計(圖2B)?？寺》治霰砻鳎坞xDiD處理對菌落形成影響不大，HF、FDH和M-FDH處理對菌落形成有一定的抑制作用。而輻射組菌落形成明顯減少。M-FDH + X射線治療顯著的細胞毒性可能是由于輻射治療的協(xié)同作用，輻射介導(dǎo)的ROS和HF的產(chǎn)生。輻射后，M-FDH在輻射作用下具有有效的ROS生成活性，有利于誘導(dǎo)癌細胞的ICD(圖2C-D)。通過測量CRT暴露、HMGB1釋放和ATP分泌等DAMPs信號的表達來檢測4T1癌細胞中ICD的發(fā)生率。結(jié)果表明，M-FDH + X射線治療可誘導(dǎo)腫瘤細胞產(chǎn)生相當(dāng)大的ICD，具有誘導(dǎo)抗腫瘤免疫應(yīng)答的潛力(圖2E-H)。
圖2 M-FDH的體外療效
3. M-FDH的腫瘤聚集和瘤內(nèi)分布
4T1乳腺癌模型體內(nèi)成像檢測M-FDH和FDH的腫瘤積累。如圖3A所示，證實了M-FDH優(yōu)先在腫瘤部位積累。腫瘤血管有效的瘤內(nèi)滲透和外滲可促進腫瘤內(nèi)各種細胞成分的接觸。M-FDH較FDH具有更強的穿透腫瘤的能力(圖3C-F)，主要是由于M-FDH具有微囊激發(fā)的納米結(jié)構(gòu)。如圖1所示，M-FDH可以保留癌細胞細胞膜的仿生特性，以生物激發(fā)的方式促進其瘤內(nèi)運輸，并促進其在腫瘤組織中被各種細胞組分進一步內(nèi)化。
隨后，測量了4T1腫瘤中M-FDH對癌細胞和CAFs的可達性(圖4)。為了評估其對癌細胞的可達性，使用4T1-gfp乳腺癌細胞建立了腫瘤模型。由圖4A-B可知，M-FDH比對應(yīng)的FDH具有更好的癌細胞可及性。同時，在4T1腫瘤中，M-FDH與CAFs的共定位證明了M-FDH對CAFs的有效性，被標(biāo)記為α-SMA+/CD31-細胞(圖4C)。在腫瘤組織中，癌細胞通常嵌在多功能基質(zhì)細胞(如CAFs、TAMs和ECs)中，這些基質(zhì)細胞分布豐富且不均一。M-FDH不僅能接觸到癌細胞，還能大量被其他基質(zhì)細胞內(nèi)化，為殺死癌細胞、改造腫瘤基質(zhì)和調(diào)節(jié)抗腫瘤免疫提供了次基質(zhì)條件。
圖3 4T1腫瘤中M-FDH的聚集和瘤內(nèi)分布
圖4 在4T1腫瘤中FDH和M-FDH
對癌細胞組分和CAFs的可及性
4. 對腫瘤氧化、ROS產(chǎn)生和DNA損傷的影響
考慮到M-FDH在腫瘤內(nèi)的有效分布及其氧傳遞潛能，我們通過光聲成像測量氧合血紅蛋白信號，評估了它們在4T1腫瘤模型中改善腫瘤氧合的能力。圖5A-C證實了M-FDH對緩解腫瘤缺氧的作用。通過與FDH和M-FDH配方的比較，M-FDH在改善腫瘤氧合方面的增強效果可能是由于M-FDH中多氟碳納米系統(tǒng)和癌細胞微泡的協(xié)同作用，表現(xiàn)出突出的氧傳遞和瘤內(nèi)分布能力。鑒于腫瘤氧化作用的顯著增強，測量了M-FDH暴露于6 Gy X射線輻射時產(chǎn)生ROS的活性。結(jié)果表明，M-FDH處理在X射線照射下產(chǎn)生ROS和造成DNA損傷方面效果明顯(圖5D-E)。
圖5 M-FDH對緩解4T1腫瘤X射線照射下
腫瘤缺氧、ROS產(chǎn)生及DNA損傷的影響
5. M-FDH + X射線照射對腫瘤間質(zhì)重構(gòu)的影響
腫瘤間質(zhì)由CAFs等多種細胞成分和ECM的多種蛋白組分組成?？紤]到M-FDH在腫瘤中對CAFs具有相當(dāng)大的可及性，評估了CAFs的頻率和ECM幾種典型成分的表達，以評估M-FDH + X射線輻射對腫瘤基質(zhì)重構(gòu)的影響。經(jīng)典的CAFs被鑒定為α-SMA-、FAP-和FSP+亞型。在PBS、FDH、M-FDH處理和M-FDH + X線處理的腫瘤中，CAFs的典型標(biāo)記如α-SMA、FAP和FSP的熒光信號廣泛檢測到，但在每個處理的輻射腫瘤中明顯減少(圖6A-B)。此外，組織學(xué)檢查顯示M-FDH + X線組腫瘤組織松散，明顯核固縮和出血(圖6C)。因此，這些數(shù)據(jù)驗證了M-FDH介導(dǎo)的放療在消除腫瘤中的CAFs方面的*療效。
進一步測量了M-FDH + X射線治療對不同治療腫瘤中I型膠原、纖維連接蛋白、HA和粘連蛋白C等典型ECM成分的影響(圖7)。免疫熒光分析表明，PBS組檢測到這些典型成分的熒光信號明顯，但FDH、M-FDH和所有輻照處理均明顯降低(圖7A)。而且在M-FDH + X線處理組中，I型膠原、HA和膠原蛋白C的表達較PBS對照、未輻照M-FDH處理組、和FDH + X線處理組顯著降低了(圖7B)。結(jié)果表明，M-FDH介導(dǎo)的輻射能有效地清除ECM的主要成分。從圖6和圖7的數(shù)據(jù)可以推斷，M-FDH + X處理導(dǎo)致CAF頻率顯著降低，I型膠原、纖維連接蛋白、HA和粘連蛋白C等ECM主要成分顯著變性，導(dǎo)致腫瘤間質(zhì)屏障大規(guī)模破壞。
圖6 M-FDH介導(dǎo)的輻射對CAFs的影響
圖7 M-FDH介導(dǎo)的輻射對ECM主要成分的影響
6. M-FDH + X射線輻射增強抗腫瘤免疫的作用
鑒于M-FDH + X射線治療可有效產(chǎn)生ROS，通過檢測腫瘤中CRT的表達和HMGB1的釋放以及附近淋巴結(jié)DCs的成熟來檢測ICD誘導(dǎo)活性。M-FDH + X射線處理組的CRT熒光信號較強，熒光強度遠高于其他組(圖8A)。結(jié)果表明，M-FDH + X線治療可有效誘導(dǎo)腫瘤ICD的發(fā)生，顯示出極大的誘導(dǎo)抗腫瘤免疫應(yīng)答的潛力(圖8B-C、圖8h + X線治療組)。
由于CD8+ T細胞是發(fā)揮癌癥殺傷作用的主要效應(yīng)細胞之一，測量了M-FDH + X射線治療對4T1腫瘤中細胞毒性CD3+CD8+ T細胞浸潤的影響。M-FDH + X射線處理對CD3+CD8+ T細胞頻率的增強效果好(圖8D)。M-FDH + X線組CD8+ T細胞占CD3+ T細胞的比例比PBS組、M-FDH組和FDH + X線組增強2.83、1.73和1.32倍(**p < 0.01)。在M-FDH + X射線處理組中，表達IFN-γ的CD3+CD8+ T細胞比例較PBS對照和未輻射M-FDH組明顯提高4.41和1.88倍(圖8E)，表達顆粒酶B的CD3+CD8+ T細胞數(shù)量分別提高3.01和1.60倍(圖8F)。結(jié)果表明，M-FDH + X射線治療明顯改善了CD3+CD8+ T細胞的浸潤及其腫瘤殺傷亞型。
接下來，評估了每種治療方法對消除腫瘤中抑制性免疫細胞的影響。TAMs是腫瘤中很豐富的抑制性免疫細胞之一，主要表現(xiàn)為M2表型，流式細胞術(shù)分析為F4/80+CD206+CD80?細胞。M-FDH + X線治療組M2巨噬細胞比例與M-FDH + X射線處理M1巨噬細胞的數(shù)量比值為2.85，遠高于其他處理(圖8G)。然后，M-FDH + X射線處理后，腫瘤中MDSCs的頻率明顯下降至3.99±0.43%，與PBS對照相比減少了60.54%(圖8H)。同時，M-FDH + X射線治療后，腫瘤中Treg的數(shù)量顯著減少至21.33±1.86%，僅為PBS組的46.58%，遠低于其他治療組(圖8I)。此外，與PBS對照相比，M-FDH + X射線處理的腫瘤中TGF-β的表達明顯降低了73.26%，且遠低于其他組(圖8J)。結(jié)果表明，M-FDH + X線能明顯緩解腫瘤的免疫抑制，顯示出極大的抗腫瘤治療潛力。
圖8 M-FDH介導(dǎo)的輻射增強抗腫瘤免疫的作用
7. M-FDH + X射線治療的體內(nèi)療效
受到M-FDH + X射線治療在破壞腫瘤間質(zhì)和增強抗腫瘤免疫方面的普遍效果的啟發(fā)，我們在4T1乳腺癌模型中評估了它們的治療效果(圖9A)。在腫瘤生長譜中，M-FDH + X線治療后腫瘤生長明顯減少，腫瘤體積遠低于其他組(圖9B)。此外，各處理的體重在治療期間幾乎沒有變化。在結(jié)束時間點，M-FDH + X線治療組腫瘤體積僅為PBS對照組的16.25%，對腫瘤生長的抑制作用為83.75%。此外，M-FDH + X線治療腫瘤生長指數(shù)僅為1.94±0.38，遠低于其他治療(圖9C)。同時，M-FDH + X射線治療對腫瘤生長的有效抑制也通過評估各治療腫瘤腫塊的重量得到證實(圖9D)。
由于腫瘤基質(zhì)是限制放射治療敏感性的關(guān)鍵因素，檢測了每種治療腫瘤中CAFs的頻率。與其他處理相比，M-FDH + X射線處理導(dǎo)致α-SMA-、FAP-和FSP-表達的CAFs被全都消除(圖9E)。與PBS對照相比，M-FDH + X射線處理后α-SMA-、FAP-和FSP-表達CAFs的比例分別減少84.49%、92.04%和93.20%(圖9G)。由于輻射可在腫瘤中誘導(dǎo)強烈的DNA損傷，評估了M-FDH + X射線治療對DNA損傷和DNA修復(fù)的影響，分別使用典型的標(biāo)記γ-H2AX和PARP。在M-FDH + X射線處理組中，γ-H2AX表達明顯，但在其他組中很少可見，M-FDH + X射線處理的腫瘤中γ-H2AX信號分別比PBS對照和FDH + X射線處理的腫瘤增強了37.00和2.67倍(圖9F和H)。相比之下，未輻射組的腫瘤組織中很少檢測到典型的DNA修復(fù)標(biāo)志物PPAP，但在PBS + X射線處理的腫瘤中明顯可見(圖9F)。然而，在M-FDH + X射線處理的腫瘤中，PARP表達僅為輻射的PBS組的6.61%和FDH + X射線處理的腫瘤的22.63%，表明DNA修復(fù)的有效減少(圖9F和H)。通過比較M-FDH + X與其他的治療組，在M-FDH + X治療組中PARP的下調(diào)可能是由于活性氧的增加和DNA損傷所致，這將有利于提高放射治療的療效。結(jié)果表明，M-FDH + X射線治療在消耗CAFs、誘導(dǎo)DNA損傷和減弱DNA修復(fù)方面表現(xiàn)出顯著的療效，這可能是其具有明顯的腫瘤抑制作用的重要原因。
隨后，在PANC02誘導(dǎo)的胰腺癌模型中評估了M-FDH + X線與aPD-L1的腫瘤抑制作用(圖10A)。當(dāng)腫瘤大小達到約600mm3時，荷瘤小鼠被處死。兩劑治療后，M-FDH + X射線治療及其聯(lián)合aPD-L1治療明顯延緩腫瘤生長，而aPD-L1單藥治療對腫瘤生長幾乎沒有影響(圖10B和C)。此外，兩劑治療后，各組腫瘤小鼠的體重幾乎沒有變化(圖S24)。PBS死亡時，M-FDH + X線+ aPD-L1組的平均腫瘤體積分別為PBS、aPD-L1和M-FDH + X線組的15.91%、18.01%和52.75%。與其他治療相比，聯(lián)合治療顯著延長了生存時間(圖10D)。aPD-L1單藥治療在PANC02腫瘤模型中療效不佳可能是由于腫瘤的低免疫原性特征和免疫抑制的微環(huán)境。相比之下，M-FDH + X治療的治療方案能夠顯著誘導(dǎo)癌細胞的ICD，破壞腫瘤間質(zhì)，改善殺傷腫瘤的CD3+CD8+ T細胞的浸潤，減少免疫抑制的M2巨噬細胞和Treg細胞，顯示出與aPD-L1協(xié)同有效治療癌癥的巨大潛力。這些數(shù)據(jù)驗證了M-FDH + X線+ aPD-L1治療在延緩腫瘤生長和延長生存期方面的有效性。
圖9 M-FDH介導(dǎo)的放射抑制腫瘤生長
的體內(nèi)治療效果
圖10 M-FDH介導(dǎo)的照射及聯(lián)合aPD-L1
對PANC02胰腺腫瘤模型的體內(nèi)治療效果
結(jié)論
綜上所述，作者合理地設(shè)計了一種負載DiIC18(5)和HF (M-FDH)的癌細胞微囊性氧傳遞聚氟納米體系，能夠有效穿透腫瘤組織，接近腫瘤中的侵襲性癌細胞和CAFs。在注射后6.0小時，M-FDH對腫瘤氧合的增強作用是相應(yīng)的FDH的10.98倍。在X射線照射下，M-FDH + X射線處理導(dǎo)致活性氧的高效產(chǎn)生，隨之而來的是強烈的DNA損傷和超過90%的CAFs和細胞外基質(zhì)的主要成分消除。M-FDH + X線處理后，4T1腫瘤中CD3+CD8+ T細胞及IFN-γ和顆粒酶B表達亞型的頻率明顯提高2.83、4.41和3.01倍，M2巨噬細胞、MDSCs和Tregs的比例分別顯著降低68.45%、60.54%和53.42%。M-FDH + X線治療對兩種小鼠腫瘤模型的腫瘤生長均有明顯抑制作用。綜上所述，仿微泡型氧氣遞送納米系統(tǒng)為臨床放療提供了一種令人鼓舞的治療策略，它可以有效增加腫瘤的氧合，規(guī)避癌癥放療的挑戰(zhàn)，破壞腫瘤間質(zhì)，引發(fā)抗腫瘤免疫反應(yīng)，從而與aPD-L1協(xié)同進行癌癥聯(lián)合治療。
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