文獻(xiàn)背景
纖維化或無序的纖維組織形成,是由異常的成纖維細(xì)胞激活,過度的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)重塑引起,可導(dǎo)致多器官功能障礙。小分子藥物如吡非尼酮和尼達(dá)尼布進(jìn)行抗肝纖維化治療的臨床療法具有適度的療效、有限的適應(yīng)癥和嚴(yán)重的副作用,因此迫切需要針對纖維化的替代臨床干預(yù)療法。
肌成纖維細(xì)胞的激活和增殖在纖維化形成中具有核心作用,特異性阻斷肌成纖維細(xì)胞的激活是一種很有潛力的療法。TGF-β、IL-11、IL-13和IL-17等細(xì)胞因子已被證明在介導(dǎo)纖維化中發(fā)揮關(guān)鍵作用。雖然一些抗細(xì)胞因子療法如托珠單抗注射液已被美國食品和藥物管理局批準(zhǔn),取得了良好的臨床效果,但仍有部分患者臨床療效不佳。失敗的主要原因是纖維化疾病涉及多種細(xì)胞因子,單純抑制一種或幾種細(xì)胞因子可能是不夠的,或者靶外抑制這些細(xì)胞因子可能會引起嚴(yán)重的副作用。因此下一代治療有望使用局部應(yīng)用的抗細(xì)胞因子策略來靶向整體纖維化微環(huán)境。
基于自體皮膚成纖維細(xì)胞的治療來有效地減弱多器官纖維化。滅活的自體皮膚成纖維細(xì)胞具有完整的膜受體,制備簡便,經(jīng)濟(jì)可行。內(nèi)源性受體可以識別、隔離和清除某些細(xì)胞因子,可以調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的活動,但不能觸發(fā)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(圖1a)。成纖維細(xì)胞膜包裹聚乳酸-乙醇酸(PLGA)納米顆粒(FNPs)來增強(qiáng)穩(wěn)定性和促進(jìn)給藥。體外檢測多種促纖維化細(xì)胞因子與FNPs的競爭結(jié)合,三種不同器官纖維化(肝纖維化、肺纖維化和心臟纖維化)的動物模型證實FNPs在體內(nèi)具有抗纖維化效果,表明其具有良好的臨床潛力(圖1b)。
圖1
基本信息
摘要
纖維化的一個特征是肌成纖維細(xì)胞的異常激活和積聚,這是由過量的促纖維化細(xì)胞因子引起的。傳統(tǒng)的抗細(xì)胞因子療法因單純阻斷一種或幾種抗纖維化細(xì)胞因子并不能消除促纖維化的微環(huán)境而無法進(jìn)行臨床試驗。本文基于自體皮膚成纖維細(xì)胞的仿生納米顆粒來中和多種成纖維細(xì)胞靶向的細(xì)胞因子。將皮膚成纖維細(xì)胞膜融合到聚乳酸-乙醇酸上形成成纖維細(xì)胞膜包裹納米顆粒(FNPs)。FNPs可以有效清除TGF-β、IL-11、IL-13和IL-17等各種促纖維化細(xì)胞因子,從而調(diào)節(jié)促纖維化的微環(huán)境。在三種不同器官纖維化(肺纖維化、肝纖維化和心臟纖維化)的動物模型中,F(xiàn)NPs可有效減少肌成纖維細(xì)胞的積聚和纖維組織的形成,同時恢復(fù)器官功能,表明FNPs是一種潛在的治療纖維化的方法。
研究內(nèi)容及結(jié)果
1.FNPs的制備與表征
皮膚成纖維細(xì)胞表達(dá)IL-11RA、IL-13RA、IL-17RA和TGF-β RII等多種細(xì)胞因子受體(圖1c)。FNPs具有球形的核-殼結(jié)構(gòu),比未包裹的PLGA納米粒子大20 nm(圖1d-f)。FNPs具有與成纖維細(xì)胞囊泡相似的表面電荷,其聚合物分散性指數(shù)(PDI)為0.18(圖1e,g)。與PLGA相比原代心臟成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞對FNPs的攝取均顯著降低(圖1h,i)。FNPs含有TGF-β RII、IL-11RA、IL-13RA和IL-17RA多種負(fù)責(zé)細(xì)胞因子結(jié)合的受體,而RNPs作為FNPs的對照,低表達(dá)或不表達(dá)上述細(xì)胞因子受體,F(xiàn)NPs以劑量依賴的中和這四種細(xì)胞因子(圖1j,k)。
2.FNP抑制TGF-β1-誘導(dǎo)的肌成纖維細(xì)胞分化
TGF-β1刺激靜息肺成纖維細(xì)胞表達(dá)α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA),形成應(yīng)力纖維(圖2a)。FNPs可明顯改善TGF-β1誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞活化的刺激效應(yīng),α-SMA表達(dá)減少和應(yīng)力纖維形成,但RNPs沒有細(xì)胞因子中和作用(圖2a-c)。TGF-β1可增強(qiáng)肺成纖維細(xì)胞的增殖能力、收縮能力和遷移能力,F(xiàn)NPs存在時TGF-β1誘導(dǎo)的上述效應(yīng)被顯著抑制,且在RNPs中略強(qiáng)(圖2d-f)。TGF-β1刺激下NMuMG細(xì)胞間黏附連接被破壞,E-鈣粘素表達(dá)下調(diào),α-SMA表達(dá)增加,F(xiàn)-肌動蛋白從皮質(zhì)重排為應(yīng)力纖維分布(圖2g,h)。TGF-β1還增強(qiáng)了ACTA2、Vimentin、Col1a1和MMP9的mRNA的表達(dá)(圖2i)。將FNPs添加到培養(yǎng)基中可以減弱這些影響,而RNPs沒有減弱效果(圖2g-i)。
圖2
3.氣管內(nèi)注射FNPs改善博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化
小鼠每5天通過微噴霧器氣管內(nèi)吸入FNPs(50 μL,2 mg/mL)、RNPs或PBS溶液,直到觀察結(jié)束(圖3a)。FNP治療顯著延長了小鼠總生存率(FNP:65%,PBS:30%,RNP:35%)(圖3b)。第21天時,對照組小鼠有嚴(yán)重的肺損傷和纖維化,而FNP組小鼠的肺損傷和纖維化明顯減弱(圖3c,d)。通過用力肺活量、肺順應(yīng)性、用力呼氣量等監(jiān)測,F(xiàn)NP處理的小鼠的肺功能也得到了保護(hù)(圖3e)。損傷21天后,對照組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)嚴(yán)重扭曲,形成蜂窩狀纖維團(tuán)塊,F(xiàn)NP治療有效地減少了纖維化面積,并保留了正常的肺泡結(jié)構(gòu)(圖3f,g)。博萊霉素增加了肺組織中α-SMA和I型膠原的染色,F(xiàn)NP組顯著減少,但RNP組沒有顯著減少(圖3f,h)。FNP組小鼠肺中纖維連接蛋白、I型膠原和α-SMA顯著減少(圖3i,j)。FNP組TGF-β1的水平顯著降低(圖3k,l),F(xiàn)NP可降低FSP-1陽性細(xì)胞百分率和FSP-1/α-SMA雙陽性細(xì)胞百分率(圖3m,n)。
圖3
4.靜脈注射FNPs改善四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)的肝纖維化
小鼠注射6周CCl4誘導(dǎo)肝纖維化,每7天接受一次FNPs、RNPs或?qū)φ罩委煟▓D4a)。隨著纖維化的發(fā)展,對照組肝臟回聲的強(qiáng)度和不均一逐漸增強(qiáng),在門靜脈區(qū)附近觀察到大范圍的纖維帶,每周靜脈注射FNPs有效地減緩了肝纖維化的進(jìn)展,肝臟回聲減少且更加均勻(圖4b,c)。FNP組的血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶濃度降低,F(xiàn)NPs治療顯著減少了纖維化區(qū)域,下調(diào)了α-SMA表達(dá)、I型膠原沉積(圖4d-f)。FNPs可降低促纖維化、促炎癥和細(xì)胞外基質(zhì)交聯(lián)相關(guān)基因的表達(dá),并恢復(fù)肝臟代謝基因的表達(dá)(圖4g)。FNPs抑制了細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體的相互作用、趨化因子的產(chǎn)生和炎癥反應(yīng)相關(guān)的基因表達(dá),并恢復(fù)了肝臟代謝(包括脂肪酸、膽汁酸、糖原、酪氨酸和藥物代謝)相關(guān)分子數(shù)據(jù)庫(MSigDB)的相關(guān)基因表達(dá)(圖4h,i)。
圖4
5.心肌內(nèi)注射FNP-海藻酸鹽水凝膠減輕局部成纖維細(xì)胞活化和膠原沉積及膠原亞型改變
FNPs與海藻酸鈣懸浮液相互作用形成離子橋制備FNP-海藻酸鹽水凝膠復(fù)合材料(圖5a)。FNPs在藻酸鹽支架中均勻分布,具有比粘性模量(G″)值高約10倍的恒定彈性模量(G′)(圖5b,c)。FNP-AH組G′值隨應(yīng)變增加而快速下降,具有高結(jié)合能力,但AH和RNP-AH對TGF-β1、IL-11、IL-13和IL-17的結(jié)合能力不足(圖5d,e)。急性炎癥中成纖維細(xì)胞增殖并被激活,導(dǎo)致大量α-SMA陽性肌成纖維細(xì)胞在梗塞區(qū)域聚集,但鄰近FNP-AH注射部位的區(qū)域α-SMA陽性細(xì)胞的數(shù)量顯著減少(圖5f,g)。膠原沉積在鄰近FNP-AH注射部位的區(qū)域也顯著減少(圖5h,i)。FNP-AH組彈性Ⅲ型膠原纖維比剛性I型膠原纖維的百分比更高(圖5j,k)。
圖5
6.FNP-AH復(fù)合材料改善心肌梗死后的心臟功能、減少纖維化面積和限制了心臟重構(gòu)
結(jié)扎前降支冠狀動脈誘發(fā)心肌梗死,在缺血區(qū)和邊緣區(qū)多點注射FNP-AH、RNP-AH或AH來誘導(dǎo)MI(圖6a)。FNP-AH可改善心肌梗死組的生存,但AH或RNP-AH不能改善生存(圖6b)。MI后心室損害的改善保持了四周(圖6d)。左心室擴(kuò)張在FNP-AH組中也得到顯著預(yù)防,F(xiàn)NP-AH組中心肌細(xì)胞存活率顯著增加(圖6e-g)。FNP-AH組纖維化顯著改善,AH和RNP-AH組也有中度改善,F(xiàn)NP-AH、RNP-AH和AH組的室壁厚度明顯高于MI組(圖6h-j)。與MI組相比FNP-AH組的楊氏模量顯著降低,RNP-AH組和AH組的楊氏模量中度降低(圖6k,l)。FNP-AH組邊緣的心肌細(xì)胞的橫截面積明顯低于其他組(圖6m,n)。
圖6
結(jié)論
該研究開發(fā)了一種基于自體皮膚成纖維細(xì)胞生產(chǎn)抗纖維化藥物的簡便方法,在細(xì)胞資源、成本和時間方面具有明顯優(yōu)勢。對MI高風(fēng)險的患者可以預(yù)先建立細(xì)胞庫來收集皮膚成纖維細(xì)胞,生產(chǎn)足量成纖維細(xì)胞衍生膜用于個體化FNP治療,來自誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的成纖維細(xì)胞可用于為急性損傷患者制造FNPs。為進(jìn)一步促進(jìn)其臨床轉(zhuǎn)化,應(yīng)繼續(xù)研究其在逆轉(zhuǎn)纖維化中的潛在作用,通過遺傳方法擴(kuò)大細(xì)胞膜的中和能力,并在其他纖維化模型中測試其治療效果。
索萊寶產(chǎn)品亮點
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