文獻(xiàn)背景
細(xì)胞免疫療法已在腫瘤治療中取得重要的突破性成果，是最有希望消除腫瘤的治療方法之一。但該方法在實(shí)際臨床應(yīng)用中仍存在著困難與挑戰(zhàn)。最大的局限性是靶材料胞內(nèi)遞送的有效性，這是很多基因編輯免疫療法中的關(guān)鍵步驟。因此需要開發(fā)高效、低細(xì)胞損傷且具有高通量的胞內(nèi)遞送方法，來(lái)實(shí)現(xiàn)大規(guī)模臨床應(yīng)用。脂質(zhì)體或聚合物誘導(dǎo)的內(nèi)吞方法對(duì)大多數(shù)細(xì)胞具有價(jià)值，但是不適合免疫細(xì)胞，因?yàn)槊庖呒?xì)胞能夠?qū)⑦@類遞送載體識(shí)別為外來(lái)敵對(duì)物并將其清除。與由質(zhì)粒DNA或mRNA間接表達(dá)的載體傳遞系統(tǒng)（即脂質(zhì)體、聚合物、慢病毒等）相比，更理想的方法是直接遞送蛋白質(zhì)，它可以消除質(zhì)粒表達(dá)的過(guò)程，減少培養(yǎng)時(shí)間，從而提高轉(zhuǎn)染效率，降低風(fēng)險(xiǎn)。
近年來(lái)，基于瞬時(shí)膜變形破壞的胞內(nèi)傳遞技術(shù)備受重視，其幾乎可以遞送任何亞微米級(jí)靶材料，廣泛適用于各種細(xì)胞。例如電穿孔技術(shù)，能夠通過(guò)在特定電壓和頻率下一系列的電脈沖來(lái)控制細(xì)胞膜的瞬時(shí)膜變形破壞（即膜的快速打開和關(guān)閉）使靶物質(zhì)能夠瞬間遞送到細(xì)胞內(nèi)，為免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)染提供了機(jī)會(huì)。但這類方法缺乏對(duì)膜穿孔變形的精確控制，過(guò)度的電場(chǎng)會(huì)對(duì)細(xì)胞行為產(chǎn)生不可預(yù)測(cè)的影響外，還可能導(dǎo)致細(xì)胞成分損傷（如蛋白質(zhì)變性等）。相比之下，微流控和納米技術(shù)可以精確地控制膜擾動(dòng)，從而實(shí)現(xiàn)瞬時(shí)膜穿孔和隨后的胞內(nèi)遞送，在解決胞內(nèi)遞送問(wèn)題中具有潛力。微流控和納米結(jié)構(gòu)可以適用于多種不同哺乳動(dòng)物細(xì)胞體積和不同尺寸的細(xì)胞膜實(shí)現(xiàn)膜穿孔。細(xì)胞膜的機(jī)械擾動(dòng)可通過(guò)微流體剪切、尖銳微納米結(jié)構(gòu)的擠壓和其他手段來(lái)實(shí)現(xiàn)，納米技術(shù)與激光或電的結(jié)合已經(jīng)證明了膜穿孔的可行性。這種方法可獲得很好的胞內(nèi)遞送效果，遞送效率約80%。納米針可在細(xì)胞表面相當(dāng)小的區(qū)域內(nèi)集中作用力，實(shí)現(xiàn)精確的膜穿孔和靶物質(zhì)的胞內(nèi)遞送，在解決細(xì)胞內(nèi)傳遞效率和細(xì)胞活力方面具有巨大潛力。但其應(yīng)用于懸浮細(xì)胞例如NK細(xì)胞、T細(xì)胞等時(shí)仍然存在困難，這類細(xì)胞不能自發(fā)的接觸納米針，需要在微流控和表面區(qū)域共同作用下進(jìn)行精確捕獲和控制，因此阻礙了納米針在免疫細(xì)胞的胞內(nèi)遞送和隨后的免疫治療中的應(yīng)用。目前的微納米結(jié)構(gòu)胞內(nèi)傳遞技術(shù)受到低通量或小劑量的限制，微納米結(jié)構(gòu)的小組裝面積是影響其進(jìn)一步發(fā)展到高通量的關(guān)鍵問(wèn)題。因此，目前仍需開發(fā)針對(duì)懸浮免疫細(xì)胞的膜穿孔系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)高效、低損傷、高通量的胞內(nèi)遞送方法，進(jìn)而提高其真正的臨床應(yīng)用潛力。
基本信息
摘要
細(xì)胞內(nèi)傳遞和基因修飾為腫瘤免疫治療帶來(lái)了重大變革，但現(xiàn)有方法受限于遞送效率低、通量差、細(xì)胞損傷過(guò)度或不適于懸浮免疫細(xì)胞，特別是對(duì)難轉(zhuǎn)染的自然殺傷細(xì)胞。通過(guò)振動(dòng)輔助納米針/微流控復(fù)合系統(tǒng)利用大面積的納米針在振動(dòng)下快速穿刺和分離微通道中快速移動(dòng)的懸浮細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)連續(xù)高通量的細(xì)胞內(nèi)遞送。通過(guò)大面積自組裝技術(shù)和微通道所制備的納米針陣列可以最大限度提高遞送效率。Cas9核糖核蛋白復(fù)合物（Cas9/RNPs）具有足夠的細(xì)胞膜納米穿孔尺寸可直接遞送到細(xì)胞內(nèi)，對(duì)于難轉(zhuǎn)染的免疫細(xì)胞，遞送效率高可達(dá)98%，細(xì)胞活力保持在80%左右。此外其通量顯著高于常規(guī)遞送技術(shù)，基因編輯CD96敲除的NK-92細(xì)胞通過(guò)逆轉(zhuǎn)衰竭具有更高的免疫力，實(shí)現(xiàn)高通量、高效率和低損傷性能的胞內(nèi)遞送，該策略提高了胞內(nèi)免疫療法的臨床應(yīng)用潛力。
研究?jī)?nèi)容及結(jié)果
1.納米針/微流控復(fù)合胞內(nèi)遞送系統(tǒng)的設(shè)計(jì)與作用機(jī)理
由硅納米針陣列基底和PDMS微通道組成的細(xì)胞內(nèi)遞送芯片的示意圖（圖1a、1b）。散射區(qū)由微米柱陣列組成，可使細(xì)胞充分分散防止它們粘成團(tuán)塊（圖1c）。平行微通道的高度略高于細(xì)胞直徑，可使細(xì)胞分別穿過(guò)穿孔區(qū)域，避免細(xì)胞堆積和阻塞，提高細(xì)胞內(nèi)遞送的陽(yáng)性率和通量（圖1d）。不同流道中的流場(chǎng)條件保持高度一致（圖1e）。在穿刺區(qū)平行通道的下方覆蓋了大面積硅納米針陣列，通過(guò)機(jī)械穿刺實(shí)現(xiàn)精確的膜穿孔（圖1f）。機(jī)械振動(dòng)驅(qū)使細(xì)胞在微通道中相對(duì)運(yùn)動(dòng)，使細(xì)胞能夠快速與納米針碰撞和脫離，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞膜的快速穿孔（圖1g）。納米針的膜穿孔大小可以充分滿足要求，可使大分子、蛋白質(zhì)等物質(zhì)從周圍介質(zhì)擴(kuò)散到細(xì)胞內(nèi)基質(zhì)中（圖1g）。典型“站立姿勢(shì)"細(xì)胞被刺穿并連接到納米針基底上（圖1h）。圖1i是凍干后納米針穿刺殘留細(xì)胞膜的掃描電鏡圖，可直觀地顯示膜穿孔。
圖1
2.高質(zhì)量大面積納米針表面結(jié)構(gòu)的制備
高質(zhì)量大面積納米針表面結(jié)構(gòu)的制備策略示意圖（圖2a）。反應(yīng)離子刻蝕（RIE）可以調(diào)整納米顆粒的直徑，形成非密堆積結(jié)構(gòu)，調(diào)整RIE工藝可以精確控制納米顆粒的直徑（圖2b）。電子束蒸發(fā)沉積和超聲波去除納米顆?？梢垣@得多孔金膜（圖2c）。納米柱的直徑可以通過(guò)調(diào)整化學(xué)蝕刻來(lái)精確控制（圖2d），通過(guò)RIE可以獲得大面積納米針陣列結(jié)構(gòu)（圖2e）。
圖2
3.振動(dòng)輔助納米針/微流控復(fù)合胞內(nèi)遞送條件的優(yōu)化
振動(dòng)頻率從40到70 Hz對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響最小，只有當(dāng)頻率達(dá)到70 Hz時(shí)，細(xì)胞形態(tài)才開始輕微變化（圖3）。與振動(dòng)頻率相比，加速度對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響更為顯著，另外流速對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響很?。▓D3）。與對(duì)照組相比，細(xì)胞內(nèi)遞送組具有更高的熒光強(qiáng)度（圖1h，i）；細(xì)胞內(nèi)遞送組的細(xì)胞形態(tài)狀況良好，無(wú)明顯變化（圖4a）。與對(duì)照組相比，在僅振動(dòng)組或僅納米針組中沒(méi)有觀察到信號(hào)；當(dāng)振動(dòng)和納米結(jié)構(gòu)共存時(shí)，細(xì)胞內(nèi)遞送性能顯著提高，F(xiàn)ITC熒光陽(yáng)性率超過(guò)90%；納米結(jié)構(gòu)的形態(tài)影響其胞內(nèi)遞送效率，納米針組的細(xì)胞內(nèi)遞送效率（超過(guò)90%）遠(yuǎn)高于錐形組的納米ke的細(xì)胞內(nèi)遞送效率（約40%）（圖4b，c）。在不同流速下，細(xì)胞內(nèi)遞送陽(yáng)性率保持在90%以上；在低流速和過(guò)高流速下，細(xì)胞活力顯著降低；當(dāng)流速為50 μL/min和400 μL/min時(shí)，細(xì)胞活力下降；在200 μL/min的優(yōu)化流速下，細(xì)胞活力高達(dá)80%，同時(shí)保持超過(guò)90%的細(xì)胞內(nèi)遞送效率（圖4d）。使用K562、人乳腺癌細(xì)胞（MDA-MB-231）、原代T細(xì)胞和NK-92來(lái)評(píng)估FITC標(biāo)記的葡聚糖通過(guò)該細(xì)胞內(nèi)遞送方法的遞送效率，葡聚糖以高于90%的遞送效率成功地遞送到所有細(xì)胞中（圖4e）。
圖3
圖4
4.CRISPR-cas 9的遞送和基因編輯NK-92細(xì)胞模型的構(gòu)建
細(xì)胞內(nèi)遞送組中可觀察到GFP熒光（圖5a）。Cas9 + GFP的細(xì)胞內(nèi)遞送效率高達(dá)約98%，細(xì)胞死亡率僅為約20%（圖5b，c）。脂質(zhì)體胞內(nèi)傳遞的遞送陽(yáng)性率僅為5%左右（圖5d）。電穿孔的遞送效率和細(xì)胞存活率分別約為40%和50%（圖5e，f）。與NK-92細(xì)胞相比，敲除效率約為46%（圖5h）。CD96位點(diǎn)存在明顯的基因切割（圖5i）；基因敲除后CD96蛋白的表達(dá)明顯減弱（圖5j）；敲除CD96后NK-92細(xì)胞的IFN-γ水平明顯升高（圖5k）。細(xì)胞內(nèi)遞送量超過(guò)50 mL，遞送效率可保持在90%以上（圖5l）。與對(duì)照組相比，CD96?NK-92細(xì)胞通過(guò)逆轉(zhuǎn)衰竭具有更高的免疫力（K562死亡率在0至12小時(shí)期間較高）（圖6a）。CD96?NK-92組K562細(xì)胞12 h后死亡率比對(duì)照組高10%以上（圖6b）。未來(lái)將構(gòu)建一個(gè)原型來(lái)實(shí)現(xiàn)真正臨床應(yīng)用的目的（圖6c）。
圖5
圖6
結(jié)論
近年來(lái)細(xì)胞免疫不斷發(fā)展，基因修飾NK細(xì)胞的免疫治療機(jī)制日益明確，瓶頸問(wèn)題是如何有效實(shí)現(xiàn)靶材料的胞內(nèi)遞送和基因編輯。高效、標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞內(nèi)傳遞技術(shù)是其進(jìn)一步發(fā)展的關(guān)鍵?；谖⒓{米粒子自組裝模板的制備技術(shù)是形成大面積微納米陣列結(jié)構(gòu)的重要手段之一。作者將大面積納米針與微流控技術(shù)相結(jié)合形成振動(dòng)輔助納米針/微流控復(fù)合系統(tǒng)，納米針的尺寸與靶Cas9蛋白相匹配且通過(guò)機(jī)械膜穿孔成功實(shí)現(xiàn)了高通量、高效和低損傷的NK-92胞內(nèi)遞送和遺傳修飾。CD96敲除NK-92細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，抑制CD96可顯著提高NK-92細(xì)胞的免疫功能，表明該系統(tǒng)進(jìn)一步在免疫治療臨床應(yīng)用中的巨大潛力。
與目前的CAR-T免疫治療方法相比，NK細(xì)胞相關(guān)的免疫治療具有更好的安全性、多種激活細(xì)胞毒活性的機(jī)制等優(yōu)點(diǎn)。一旦安全性和制備方面的問(wèn)題得到解決，其有望在癌癥治療中帶來(lái)更好的效果，NK-92細(xì)胞基因編輯結(jié)果表明該系統(tǒng)能實(shí)現(xiàn)這一功能。未來(lái)工作中將構(gòu)建原型，以達(dá)到真正臨床應(yīng)用的目的。
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